Валидация методики на основе биослойной интерферометрии для определения связывающих (общих) антител к ромиплостиму в сыворотке крови человека

ВВЕДЕНИЕ

Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП) — редкое аутоиммунное заболевание, характеризующееся низким количеством тромбоцитов. Использование препаратов агонистов тромбопоэтинового рецептора, в число которых входит ромиплостим, увеличивает продолжительность и улучшает качество жизни пациентов с ИТП [1][2]. Вывод на фармацевтический рынок препарата ромиплостима российского производства способствует большей доступности терапии нуждающимся в ней пациентам.

Ромиплостим представляет собой гибридный белок, состоящий из Fc-фрагмента человеческого IgG1, С-конец каждой цепи которого ковалентно связан с пептидом, содержащим два фрагмента, которые взаимодействуют с тромбопоэтиновым рецептором. В клинических исследованиях оригинального препарата ромиплостима выявление общих антилекарственных антител (оАЛА) проводили с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR). Вероятность развития клинически значимого иммунного ответа на данный препарат является низкой [3]. Однако образование АЛА может приводить к развитию серьезных неблагоприятных явлений [4]. Поэтому при разработке биоаналогичного препарата необходимо изучить его иммуногенность с помощью надежной и устойчивой методики.

Международными регуляторными органами рекомендовано использование многоуровневого подхода к оценке оАЛА¹, который состоит из последовательных этапов: скрининг-теста, подтверждающего теста и оценки титра. Мониторинг изменения титра оАЛА помогает интерпретировать данные фармакокинетики, фармакодинамики и клинических наблюдений [5][6].

Для обнаружения оАЛА используются различные методы, включая иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), электрохемилюминесцентный иммуноанализ (electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA), SPR и биослойную интерферометрию (bio-layer interferometry, BLI) [7]. По сравнению с ELISA и ECLIA, метод BLI имеет более низкую чувствительность, но потенциально более устойчив к присутствию лекарственного препарата в анализируемых образцах [8] и позволяет обнаруживать низкоаффинные антитела, характерные для раннего иммунного ответа² [7][9][10].

В данной работе впервые в клинических исследованиях ромиплостима предлагается использовать BLI для определения оАЛА. С помощью метода BLI так же, как и SPR, можно детектировать образование белковых комплексов в режиме реального времени. Для измерительных приборов на основе SPR характерна проблема загрязнения сывороткой крови каналов, служащих для доставки образца на поверхность биосенсорного чипа. В BLI используется подход «dip-and-read», при котором биосенсоры погружаются в лунки планшета, содержащие образцы, что исключает описанную выше проблему [7][9].

Цель работы — установить ключевые валидационные характеристики методики, основанной на биослойной интерферометрии, для определения общих антилекарственных антител к ромиплостиму в сыворотке крови человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Исследование было одобрено на заседании Межвузовского комитета по этике (Протокол № 2 от 20.02.2020) при АНО «Организационно-техническое обеспечение «МКЭ». Пробы периферической венозной крови забирали в пробирки Vacuette с активатором свертывания крови (кат. № 455059, Greiner Bio-One GmbH, Австрия) от здоровых добровольцев мужского пола в возрасте от 18 до 50 лет, не получавших лечение ромиплостимом. Для выделения сыворотки крови пробирки оставляли на 20–30 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 1800 g и 4 °С в течение 10 мин. Образцы сыворотки крови аликвотировали и хранили при температуре минус 80 °С до проведения анализа.

В качестве негативного контрольного образца (negative control, NC), заведомо не содержащего антилекарственных антител, использовали пулированную сыворотку крови человека «Normal human serum» (кат. № S1-100 ML, Merck Millipore, США).

Для приготовления положительных контрольных образцов (positive control, PC) в NC добавляли поликлональные кроличьи антитела, специфичные к ромиплостиму (получены в АО «ГЕНЕРИУМ»), до финальной концентрации 50 мкг/мл (очень высокий положительный контроль, VHPC), 10 мкг/мл (высокий положительный контроль, HPC), 2 мкг/мл (средний положительный контроль, MPC) и 0,8 мкг/мл (низкий положительный контроль, LPC).

Для приготовления контрольных образцов, содержащих неспецифические антитела, в NC добавляли моноклональные человеческие антитела к омализумабу (кат. № HCA235, Bio-Rad, США) до финальной концентрации 10 мкг/мл или человеческие антитела класса G (кат. № ab98981, Abcam, Великобритания) — до 20 мкг/мл.

Для конъюгирования ромиплостима с биотином использовали биоаналогичный препарат Стимплейт (серия MW00120, АО «ГЕНЕРИУМ», Россия) или оригинальный препарат Энплейт (серия 1100215A, Amgen Europe B.V., Нидерланды) и набор для биотинилирования «Biotin (Type A) Fast Conjugation Kit» (кат. № ab201795, Abcam, Великобритания).

Для оценки специфичности подтверждающего теста использовали лекарственный препарат Луцентис® (серия SH275, Novartis Pharma Stein AG, Швейцария), содержащий ранибизумаб в качестве действующего вещества.

Для приготовления буферных растворов использовали следующие реактивы: фосфатно-солевой буфер, pH 7,4, таблетки (кат. № B-60201, НПЦ «Эко-Сервис», Россия); Твин 20 (кат. № P7949, Sigma-Aldrich, США); натрия азид (кат. № A1430.0100, Panreac Applichem, Испания); глицин (кат. № 1.00590.1000, Merck, Германия). В работе использовали буферный раствор PBS-T (10 мМ фосфатно-солевой буферный раствор; 0,05% Твин 20, pH 7,2–7,6); 5% раствор NC для блокирования биосенсоров (PBS-T; 0,05% натрия азид; 5% NC); буферный раствор для разведения образцов и хранения биосенсоров (PBS-T; 0,05% натрия азид); буферный раствор для регенерации биосенсоров (20 мМ глицин-HCl, pH 2,0).

При валидации методики использовали 96-луночные несорбирующие планшеты черного цвета (кат. № 655209, Greiner Bio-One GmbH, Австрия); стрептавидиновые биосенсоры для интерферометра Octet «High Precision Streptavidin (SAX)» (кат. № 18-5117, Fortebio, США).

Метод биослойной интерферометрии

Подготовка биосенсоров. Биотинилированный ромиплостим в концентрации 10 мкг/мл сорбировали на стрептавидиновых биосенсорах при комнатной температуре в течение 2 ч. Свободные сайты связывания биосенсоров блокировали 5% NC и далее проводили 3 цикла регенерации биосенсоров раствором 20 мМ глицин-HCl.

Пробоподготовка образцов. Искажающее воздействие компонентов сыворотки крови, отличающихся от оАЛА (например, ревматоидный фактор и растворимые мишени лекарственных препаратов), которое способно приводить к получению ложных результатов, называется «эффект матрицы». Для снижения этого эффекта исследуемые и контрольные образцы в 20-кратных разведениях (минимальное необходимое разведение, МНР), приготовленных в PBS-T с добавлением 0,05% натрия азида, инкубировали при 65 °С в течение 20 мин, что, как было установлено в предварительных экспериментах, не влияло на чувствительность метода.

Для определения титра оАЛА из образцов в МНР готовили серии последовательных разведений в 5% NC.

Выполнение скрининг-теста. В лунки 96-луночного несорбирующего планшета черного цвета вносили 240 мкл образцов в МНР после пробоподготовки не менее чем в двух повторах.

Выполнение подтверждающего теста. В лунки планшета вносили 240 мкл образцов в МНР после пробоподготовки не менее чем в четырех повторах. В половину лунок, содержащих каждый анализируемый образец, добавляли ромиплостим до концентрации 20 мкг/мл.

Оценка титра оАЛА. Образцы в объеме 240 мкл (серии последовательных разведений) добавляли в лунки планшета не менее чем в двух повторах.

Детектирование белкового комплексообразования. Образование комплексов ромиплостима и антител к нему регистрировали в режиме реального времени с использованием интерферометра Octet® QKe (Pall Corporation, ForteBio, США). Рабочую температуру поддерживали на уровне 30 °С при скорости перемешивания планшета 1000 rpm. Аналитический сигнал каждого образца представлял собой сдвиг длины волны, измеренный в нм, в конце этапа ассоциации оАЛА с биотинилированным ромиплостимом в течение 17 мин. После каждого этапа ассоциации проводили два цикла регенерации биосенсоров 20 мМ глицин-HCl в течение 5 с каждый и последующее уравновешивание в 5% NC в течение 50 с.

Статистическая обработка результатов

Основные валидационные характеристики методики определяли в соответствии с рекомендациями G. Shankar с соавт. [5] и D. Jani с соавт. [11].

Оценка нормальности распределения данных в выборках при определении фактора биологической вариабельности (CPf_скр) и предельного значения незначимого ингибирования (CP_пт) осуществлялась с использованием статистического теста Д’Агостино — Пирсона в программе GraphPad Prism 8. Остальные расчеты проводились в программе Microsoft Excel 2016.

Обнаружение выбросов в исследуемых данных проводилось с помощью межквартильного интервала. Коэффициент вариации (%CV) рассчитывался как отношение стандартного отклонения (SD) к среднему значению рассматриваемой величины и выражался в процентах.

Расчет валидационных параметров

Фактор биологической вариабельности для расчета предельного значения скрининг-теста (CPf_скр) и определения титра оАЛА вычисляли по формуле (1):

(1)

где 95th percentile (logA) — 95%-й перцентиль десятичного логарифма аналитического сигнала индивидуальных образцов исследуемой выборки; A_mean — среднее значение аналитического сигнала индивидуальных образцов исследуемой выборки.

Предельное значение скрининг-теста (CP_скр) рассчитывали по формуле (2):

CP_скр = A_NC × CPf_скр, (2)

где A_NC — среднее значение аналитического сигнала негативного контрольного образца; CPf_скр — фактор биологической вариабельности для скрининг-теста и определения титра.

Образцы, значения аналитических сигналов которых превышали предельное значение скрининг-теста, считали условно положительными.

При проведении подтверждающего теста рассчитывали показатель «процент ингибирования» (%I) сигнала каждого образца в МНР с добавлением ромиплостима относительно образца в МНР без добавления ромиплостима по формуле (3):

(3)

где A_CS — среднее значение аналитического сигнала образца с добавлением ромиплостима; A_B — среднее значение аналитического сигнала образца без добавления ромиплостима.

Предельное значение незначимого ингибирования (CP_пт) рассчитывали по формуле (4):

CP_ПТ = %I + 3,09 × SD_%I, (4)

где %I — среднее значение показателя «процент ингибирования» индивидуальных образцов исследуемой выборки; «3,09» — 0,999 квантиль стандартного нормального распределения; SD_%I — стандартное отклонение показателя «процент ингибирования» образцов исследуемой выборки.

Для снижения вероятности получения ложноположительных результатов взамен рекомендуемого 0,99 квантиля [11] в расчетах использовали 0,999 квантиль стандартного нормального распределения.

Образцы, значение показателя %I которых превышало CP_пт, считали положительными по наличию оАЛА.

Разведение, при котором аналитический сигнал образца соответствует значению CP_скр, принимали в качестве титра оАЛА в положительных контрольных образцах.

Оценка прецизионности методики для определения антител к ромиплостиму включала в себя доказательство воспроизводимости и повторяемости результатов.

Прецизионность результатов скрининг-теста оценивали по нормированным коэффициентам (K). Для оценки воспроизводимости нормированные коэффициенты (K_воспр) рассчитывали по формуле (5):

(5)

где A_PC — среднее значение аналитического сигнала положительного контрольного образца (PC) в опыте; CP_скр — предельное значение скрининг-теста.

Аналогичным образом рассчитывали нормированные коэффициенты для оценки повторяемости, но используя значение аналитического сигнала PC отдельного повтора вместо среднего значения сигнала.

Для оценки воспроизводимости и повторяемости подтверждающего теста рассчитывали значения показателя %I по формуле (3), используя средние значения аналитических сигналов и значения аналитических сигналов в отдельных повторах соответственно.

Воспроизводимость результатов определения титра оАЛА оценивали, рассчитывая медиану полученных значений титра оАЛА каждого PC. Максимальное и минимальное допустимые значения титра определяли путем умножения и деления медианного значения на 2,5 (максимальный коэффициент кратности серии разведений для расчета титра).

Нижний предел детекции (НПД) опыта вычисляли по формуле (6):

(6)

где С — концентрация оАЛА в PC, нг/мл; Титр — рассчитанный в опыте титр оАЛА в PC; «20» — минимальное необходимое разведение.

НПД методики рассчитывали как сумму среднего значения НПД по всем опытам и значения трех стандартных отклонений.

Устойчивость методики к присутствию в образцах лекарственного препарата характеризовали по коэффициенту выявления (%R), который рассчитывали по формуле (7):

(7)

где A_{с внесением} — среднее значение аналитического сигнала контрольного образца с внесением препарата; A_{без внесения} — среднее значение аналитического сигнала контрольного образца без внесения препарата.

Стабильность биосенсоров с иммобилизованным ромиплостимом для каждого исследуемого PC оценивали по значениям %R, которые рассчитывали по отношению значений аналитических сигналов, полученных при использовании биосенсоров после хранения и до закладки на хранение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Перечень оцененных валидационных характеристик и критерии приемлемости представлены с учетом текущих требований нормативной документации³.

Определение фактора биологической вариабельности для расчета предельного значения скрининг-теста и определения титра оАЛА

Для определения фактора биологической вариабельности (CPf_скр) были проанализированы 48 образцов сыворотки крови человека. Образцы анализировали два исследователя, каждый из которых провел три независимых опыта в разные дни. Один опыт включал в себя скрининг-тест всех исследуемых образцов.

Результаты статистического теста Д’Агостино–Пирсона показали, что распределение значений аналитического сигнала образцов исследуемой выборки не соответствует нормальному. Значения аналитических сигналов были преобразованы в соответствующие значения десятичного логарифма, при этом два образца были исключены из расчета CPf_скр как выбросы. Среднее значение CPf_скр составило 1,481.

Определение предельного значения незначимого ингибирования для подтверждающего теста

Вычисленное значение незначимого ингибирования аналитического сигнала, выраженное в процентах, разделяющее исследуемые образцы на подтвержденные или неподтвержденные по наличию оАЛА, называют предельным значением незначимого ингибирования для подтверждающего теста (CP_пт) [12].

Оценка CP_пт проводилась на той же выборке и при тех же условиях, что и оценка CPf_скр. Значения показателя %I аналитического сигнала образцов исследуемой выборки характеризовались нормальным распределением; выбросы не были выявлены. Значение CP_пт подтверждающего теста составило 34,2%.

Оценка прецизионности результатов методики

Для оценки воспроизводимости методики были проанализированы образцы PC и NC двумя исследователями в разные дни (табл. S1, опубликована на сайте журнала⁴). Для оценки повторяемости каждый контрольный образец был проанализирован в 6 повторах одним исследователем в одном опыте (табл. S2, опубликована на сайте журнала⁵).

При оценке результатов руководствовались следующими критериями приемлемости:

• коэффициент вариации между значениями нормированного коэффициента (K) при проведении скрининг-теста или между значениями показателя %I при проведении подтверждающего теста должен составлять ≤20% при оценке повторяемости и ≤25% при оценке воспроизводимости;
• значения титра оАЛА не должны отклоняться от рассчитанного медианного значения более чем в 2,5 раза.

На рисунке 1 приведен пример сенсограммы, полученной при определении титра оАЛА в образце VHPC.

При оценке воспроизводимости и повторяемости коэффициент вариации значений показателя K не превышал 6,7 и 10,5%, а показателя %I — 3,0 и 7,8% соответственно. Полученные значения титра оАЛА при оценке воспроизводимости отличались от медианного значения не более чем в 2,1 раза (табл. S1, табл. S2).

Результаты оценки прецизионности удовлетворяли установленным критериям приемлемости.

Оценка нижнего предела детекции скрининг-теста

Значение НПД оАЛА к ромиплостиму определяли по данным 6 независимых опытов, выполненных двумя исследователями в разные дни. Образцы HPC анализировали в серии разведений от 1/20 до 1/2000. Несмотря на то, что поликлональные кроличьи антитела не могут полностью отражать свойства человеческих антител, образующихся в ответ на введение ромиплостима, их использование на этапе разработки позволило оптимизировать условия анализа, повысив его чувствительность [13][14]. Значение НПД методики по обнаружению поликлональных кроличьих антител к ромиплостиму составило 622 нг/мл.

Оценка эффекта высокой дозы при проведении скрининг-теста и подтверждающего теста

Эффект высокой дозы — распространенное явление, при котором из-за ограниченного количества иммобилизованного препарата и чрезвычайно высоких концентраций антител в образце происходит снижение образования комплексов антиген/антитело. Эффект высокой дозы способен приводить к получению ложноотрицательных результатов [15].

Для определения эффекта высокой дозы в скрининг-тесте и подтверждающем тесте использовали образцы VHPC и HPC. Предельное значение скрининг-теста в проведенном опыте составило 0,1552. Более высокой концентрации антител соответствовал более высокий уровень аналитического сигнала в скрининг-тесте и большее значение показателя %I (табл. S3, опубликована на сайте журнала⁶). Эффект высокой дозы при анализе образцов VHPC и HPC отсутствовал.

Вероятность возникновения эффекта высокой дозы крайне мала при анализе образцов, содержащих нативные человеческие антитела к ромиплостиму, которые характеризуются более низкой аффинностью по сравнению с антителами, используемыми в положительных контрольных образцах [13]. Для снижения вероятности получения ложноотрицательных результатов использовали дополнительные разведения образцов, аналитический сигнал которых соответствовал VHPC, при этом сохранялось 5%-ное содержание сыворотки в разведениях образцов.

Эффект матрицы при проведении скрининг-теста и подтверждающего теста

Для оценки эффекта матрицы в индивидуальные образцы сыворотки крови здоровых добровольцев, не получавших ранее лечение ромиплостимом, добавляли поликлональные кроличьи антитела к ромиплостиму до финальной концентрации 800 нг/мл. В качестве образцов сравнения служили образцы сыворотки крови без добавления антител.

По данным скрининг-теста, аналитические сигналы 9 из 10 образцов без добавления антител были ниже предельного значения скрининг-теста (0,158); один образец IS31 показал ложноположительный результат (табл. 1). Аналитические сигналы всех образцов, содержащих антитела к ромиплостиму, включая IS31, были охарактеризованы как условно положительные. При этом аналитические сигналы 8 из 10 образцов, содержавших оАЛА, превышали таковые образцов сравнения более чем в 1,481 раза (табл. 1).

Результаты оценки эффекта матрицы при проведении подтверждающего теста приведены в таблице 2. Для 8 из 10 проанализированных образцов значения показателя %I превышали значения CP_пт.

Аналитический сигнал образцов IS06 и IS31 после добавления в них антител к ромиплостиму вырос менее чем в 1,481 раза. С одной стороны, в скрининг-тесте было установлено, что аналитические сигналы данных образцов без добавления антител были несколько повышены относительно среднего значения сигнала по выборке (табл. 1). С другой стороны, значения показателя %I образцов IS06 и IS31 были ниже значения CP_пт (табл. 2). Эти наблюдения могут быть обусловлены неспецифическим связыванием с биосенсором компонентов сыворотки крови, препятствующих связыванию антител. Предположительно, при более высоких (>800 нг/мл) концентрациях антител к ромиплостиму в образцах вероятность получения ложноположительных результатов в подтверждающем тесте будет минимальна.

Оценка специфичности методики при проведении скрининг-теста и подтверждающего теста

При проведении скрининг-теста усредненные значения аналитических сигналов контрольных образцов, содержащих 10 мкг/мл антител к омализумабу или 20 мкг/мл человеческих антител класса G, составили 0,1070 и 0,1029 соответственно и были ниже предельного значения скрининг-теста (0,166). Ложноположительных результатов не наблюдалось.

При проведении подтверждающего теста добавление в образцы ромиплостима в качестве антигена должно приводить к ингибированию сигнала связывания специфических антител, не оказывая влияния на антитела иной специфичности⁷. В таблице S4 (опубликована на сайте журнала⁸) показаны результаты анализа контрольных образцов, содержащих разные концентрации антител к ромиплостиму, а также ромиплостим или ранибизумаб. В качестве сравнения анализировали образцы, не содержавшие антигенов.

В отличие от ромиплостима, добавление ранибизумаба в качестве неспецифического антигена значимо не ингибировало связывание антител с ромиплостимом. Таким образом, неспецифическое ингибирование аналитического сигнала при проведении подтверждающего теста отсутствовало.

Оценка устойчивости методики к присутствию в образцах лекарственного препарата и его мишени

Мишенью ромиплостима является рецептор тромбопоэтина — трансмембранного белка, расположенного на поверхности тромбоцитов и мегакариоцитов [16]. За исключением случаев контаминации образцов клетками крови при ненадлежащей пробоподготовке, присутствие рецептора тромбопоэтина в образцах сыворотки крови не предполагается. Следовательно, вероятность возникновения ложноположительных результатов крайне низкая и оценивать влияние белка-мишени на результаты анализа не требуется.

Лекарственный препарат в свободной форме или в форме иммунных комплексов с оАЛА может присутствовать в исследуемых образцах. Поэтому важно оценить устойчивость методики определения оАЛА к ромиплостиму к присутствию последнего, для чего анализировали контрольные образцы, содержавшие 0,8, 2, 10 мкг/мл специфических антител и 1 нг/мл ромиплостима (табл. S5, опубликована на сайте журнала⁹).

По данным J. Qi с соавт. [17], при еженедельном введении ромиплостима в течение 2 нед. максимальная концентрация препарата в сыворотке крови пациентов с ИТП составила 52 и 105 пг/мл при применении препарата в дозе 1 мкг/кг и 3 мкг/кг ромиплостима соответственно [17]. Следовательно, концентрация 1 нг/мл в целом превышает предполагаемый диапазон концентраций ромиплостима в образцах сыворотки крови пациентов, получающих лечение ромиплостимом, и соответствует требованиям к устойчивости методики определения оАЛА в присутствии лекарственного препарата в образцах¹⁰.

Исследования показали, что при анализе образцов, содержащих 1 нг/мл ромиплостима, снижение регистрируемого сигнала отсутствовало.

Оценка устойчивости результатов скрининг-теста и подтверждающего теста к замене компонентов аналитической системы

Для оценки устойчивости результатов скрининг-теста и подтверждающего теста к замене компонентов аналитической системы образцы PC анализировали с использованием биосенсоров, сорбированных биотинилированным ромиплостимом, приготовленным из оригинального или биоаналогичного препарата. В подтверждающем тесте в исследуемые образцы добавляли оригинальный препарат ромиплостима в качестве специфичного антигена. Результаты данного анализа сравнивали с результатами анализа образцов, содержащих биоаналогичный препарат.

Экспериментально подтверждена сопоставимость уровней аналитического сигнала независимо от вида используемого препарата, что свидетельствует о возможности применения методики для оценки клинических образцов, содержащих оАЛА, выработанные в ответ на введение как оригинального, так и биоаналогичного препаратов (табл. S6, опубликована на сайте журнала¹¹).

Оценка стабильности иммобилизованного на биосенсорах ромиплостима после хранения и регенераций

Стабильность биосенсоров с иммобилизованным биотинилированным ромиплостимом после длительного хранения и регенерации оценивали путем определения оАЛА в образцах с использованием биосенсоров, которые хранили в течение 2 нед. при температуре 5±3 °C и подвергали не менее 20 циклам регенерации.Результаты оценки стабильности приведены в таблице 3.

В качестве критерия приемлемости использовался диапазон значений коэффициента выявления %R — от 80 до 120%. Согласно полученным данным, иммобилизованный на биосенсорах биотинилированный ромиплостим был стабилен после хранения в течение 2 нед. при температуре 5±3 °C и не менее 20 циклов регенерации.

ВЫВОДЫ

1. Результаты проведенной валидации подтверждают пригодность разработанной методики для получения достоверных и воспроизводимых результатов при определении оАЛА к ромиплостиму в образцах сыворотки крови человека.
2. Доказана применимость методики для оценки связывающих антител к ромиплостиму в образцах сыворотки крови человека, образующихся в ответ на введение как оригинального, так и биоаналогичного препаратов.
3. Метод биослойной интерферометрии может применяться для определения оАЛА, в том случае, если компоненты сыворотки крови оказывают значительное влияние на результаты анализа.
4. Преимущество разработанной методики заключается в возможности определения оАЛА в образцах, содержащих 1 нг/мл ромиплостима.
5. Анализ 96-луночного планшета занимает 4 ч, включая этап пробоподготовки образцов.
6. Регенерация биосенсоров позволяет выполнить не менее 20 независимых измерений связывания оАЛА с ромиплостимом без потери качества данных.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» опубликованы таблицы S1–S6.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s2

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s3

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s4

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s5

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s6

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.А. Агафонова — написание текста рукописи, формулирование выводов, работа с источниками литературы; М.В. Жиляева — планирование исследования, выполнение экспериментальных работ, интерпретация результатов исследования; И.В. Лягоскин — постановка цели, руководство исследованием, работа с текстом и критический пересмотр его содержания; А.А. Казаров — статистическая обработка данных на всех этапах валидации методики; А.Е. Лисова — доработка текста рукописи; Р.Р. Шукуров — критическая оценка содержания текста, утверждение окончательной версии рукописи для публикации.

Соответствие принципам этики. Исследование было одобрено на заседании Межвузовского комитета по этике (Протокол № 2 от 20.02.2020) при АНО «Организационно-техническое обеспечение «МКЭ».

Благодарности. Авторы выражают благодарность В.М. Симонову за ценные консультации по проводимой работе, а также всему коллективу АО «ГЕНЕРИУМ» за предоставление оборудования, материалов и содействие при проведении исследования.

Additional information. Tables S1–S6 are published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s2

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s3

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s4

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s5

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-639-table-s6

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. A.A. Agafonova wrote the manuscript, formulated conclusions, and worked with literature sources. M.V. Zhilyaeva developed the study plan, performed experimental work, and interpreted the results of the study. I.V. Lyagoskin formulated the goal, supervised the study, worked with the text and critically revised its content. A.A. Kazarov performed statistical processing of data at all stages of method validation. A.E. Lisova finalised the manuscript. R.R. Shukurov critically evaluated the content of the text, and approved the final version of the manuscript for publication.

Ethics approval. The study was approved at a meeting of the Interuniversity Ethics Committee (Protocol No. 2 of 20 February 2020) at the ANO Organisational and Technical Support of the IEC.

Acknowledgements. The authors express their gratitude to V.M. Simonov for valuable consultations on the work carried out, as well as to the entire staff of GENERIUM JSC for providing equipment and materials as well as assistance in conducting the research.