Применение принципов 3Rs для оценки качества АКДС-вакцины: преимущества и недостатки

ВВЕДЕНИЕ

АКДС-вакцина является одной из важнейших вакцин национальных календарей всех стран мира. Применение АКДС-вакцины позволило значительно снизить заболеваемость и связанную с ней смертность при реализации программ плановой иммунизации. Специфическая активность и безопасность — одни из основных показателей качества вакцины, и для их контроля требуется использование лабораторных животных на каждой стадии производства вакцины.

На момент разработки и регистрации АКДС-вакцины методы исследования на животных (далее — методы in vivo) были самыми передовыми. С 1959 г., когда впервые были выдвинуты принципы 3Rs (replacement, reduction and refinement of animal assays — замена, уменьшение, усовершенствование), ученые начали поиски новых методов контроля качества вакцин с целью замены и уменьшения количества лабораторных животных, используемых в различных испытаниях. Методы in vivo применяли на всех стадиях производства вакцины, и их замена альтернативными методами оказалась сложной задачей [1–4]. Производители вакцин в 1970-х годах, следуя принципам 3Rs, начали поиск методов in vitro, которые могли бы стать надежной альтернативой традиционным методам in vivo для оценки безопасности и специфической активности компонентов АКДС-вакцины.

С начала 90-х годов прошлого столетия в практику контроля показателей качества иммунобиологических препаратов начали постепенно внедрять альтернативные серологические методы. Однако не все производители вакцин и регуляторные органы оказались готовы к переходу от методов in vivo к методам in vitro. В июле 2021 г. Национальный центр Великобритании¹ по замене, усовершенствованию и сокращению использования животных в исследованиях (NC3Rs) по поручению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) провел опрос производителей с целью проанализировать, в какой степени методы in vivo описаны в руководствах и рекомендациях по производству и контролю качества вакцин и биотерапевтических препаратов. Большинство участников (66%) ответили, что на производстве применяют только методы in vivo, поскольку результаты этих исследований принимают все региональные регуляторные органы [5].

Основными препятствиями были и остаются различия нормативных требований в разных странах, а также большая осторожность производителей вакцин и регуляторных органов в отношении изменения методов оценки качества иммунобиологических препаратов и вакцин [6]. Проблемы, связанные с разработкой и внедрением альтернативных методов, обусловлены необходимостью продемонстрировать сопоставимость результатов нового и утвержденного (in vivo) методов и валидировать альтернативный метод в соответствии с требованиями Международного совета по гармонизации ICH Q2(R1)².

В Европейском союзе (ЕС) следование принципам 3Rs является юридическим требованием. В отношении АКДС-вакцины внесен ряд изменений, которые отражены в Европейской фармакопее (ЕФ), включая возможность совмещения тестов на реверсию токсичности и специфическую безопасность на культуре клеток Vero при оценке качества дифтерийного анатоксина (ДА). Для столбнячного анатоксина (СА) исключены испытания на реверсию токсичности, теста на аномальную токсичность и специфическую безопасность в готовой форме препарата. Для оценки специфической активности вакцин разрешены альтернативные серологические методы³.

Отсутствие всемирно гармонизированных нормативных требований с альтернативными методами является одной из основных причин, по которой вакцинная промышленность не смогла полностью внедрить описанные в ЕФ альтернативные испытания [7].

Российская Федерация в последние годы участвует в работе по созданию единых подходов к оценке качества вакцинных препаратов в странах — членах Евразийского экономического союза (ЕАЭС). Одним из основных условий данной работы является гармонизация нормативных требований ЕАЭС с рекомендациями ЕФ.

Цель работы — провести сравнительный анализ современных методов определения специфической активности компонентов АКДС-вакцины, оценить их преимущества и недостатки, выявить проблемные вопросы гармонизации методов в рамках ЕАЭС.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Общие сведения о принципах 3Rs

Принципы 3Rs впервые определены У. Расселом и Р. Берчем в книге «Принципы гуманной экспериментальной техники» более 50 лет назад [2][3]. Принципы были представлены в качестве основы для будущих разработок, и авторы сформулировали ее как «The 3Rs» (3Rs): replacement (замена), reduction (уменьшение), refinement (усовершенствование).

Принципы 3Rs были выдвинуты не только для того, чтобы помочь исследователям в поиске и использовании доступных методов, но и для поощрения разработки новых. Идеи Рассела и Берча вызвали огромный интерес в научном сообществе и стимулировали ученых и производителей к поиску новых методов оценки качества лекарственных препаратов. Термины «замена», «уменьшение» и «усовершенствование» впоследствии стали известны как «альтернативы» или «альтернативные методы» для сведения к минимуму боли и стресса у животных при проведении биомедицинских исследований [2][3]. Рассел и Берч употребляли также термин «дистресс». Современное понятие «дистресс» имеет много определений. Большинство из них характеризуют дистресс как аверсивное состояние, при котором животное не способно полностью адаптироваться к стрессорам и демонстрирует неадаптивное поведение⁴.

Сформулированные Расселом и Берчем 3Rs лежат в основе современных правил⁵ использования животных и помогают найти ученым альтернативные методы исследования, основные принципы которых направлены на:

• замену — подразумевает полное или частичное исключение или замену животных в исследовательских целях. Полная замена исключает использование любых животных; частичная замена подразумевает использование некоторых видов животных, которые, основываясь на современном научном мышлении, не считаются способными испытывать страдания;
• сокращение — относится к методам, которые минимизируют количество животных, используемых в эксперименте, в соответствии с научными целями;
• усовершенствование — относится к методам, которые сводят к минимуму боль, страдания или длительный вред, причиняемый исследуемым животным, и которые улучшают их благополучие.

В настоящее время принципы 3Rs являются неотъемлемой частью законодательства во многих странах мира.

Реализация принципов 3Rs для иммунобиологических препаратов в Европейской фармакопее

В ЕС принципы 3Rs сформулированы в Директиве ЕС 2010/63/EU, что делает их реализацию юридическим требованием⁶. Во многих странах ЕС принципы 3Rs включены в национальное законодательство и положения об использовании животных в научных процедурах, а также в политику организаций, которые финансируют или проводят исследования на животных. Следует отметить, что некоторые крупнейшие производители вакцин ставят своей целью на ближайшее десятилетие полностью отказаться от тестов на животных⁷.

Европейский директорат по качеству лекарственных средств и здравоохранения (European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM) осуществляет работу по координации коллаборативных исследований, направленных на реализацию концепции 3Rs: совместная работа по Программе биологической стандартизации, совместная деятельность Совета Европы и Комиссии Европейского союза⁸.

Эксперты ЕФ применяют одну из стратегий по реализации принципов 3Rs в разработке и внедрении фармакопейных монографий в отношении усовершенствования методов, которая заключается в использовании «гуманных конечных точек» (ГКТ) в испытаниях вакцинных препаратов. Подход к определению ГКТ основан на прекращении боли, при этом страдание экспериментального животного сведено к минимуму или уменьшено с помощью гуманной эвтаназии, прекращения болезненной процедуры или лечения для облегчения боли и/или дистресса⁹.

Чтобы установить ГКТ при тестировании эффективности вакцины, необходимо определить параметры, по которым можно предсказать смертельные исходы или тяжелые клинические проявления, связанные с выполнением теста. Как правило, используются два типа ГКТ, которые основаны на клинических проявлениях теста и патофизиологических параметрах (маркеры процесса), таких как масса и температура тела [8][9]. В частности, при определении специфической активности вакцины против столбняка в качестве ГКТ служит такая степень столбнячной интоксикации, при которой животное еще активное, но следующая стадия принесет сильные страдания и смерть (табл. 1). По международной классификации это стадия Т3 — паралич конечности, которая уже не может функционировать. Для стадии Т3 характерны тяжелые клинические проявления столбняка, поэтому гуманная эвтаназия на этом этапе уменьшит боль и страдания животного без ущерба для результатов испытания.

В качестве примера полного отказа от использования животных в экспериментальных целях можно привести метод определения специфической активности препаратов ботулинического токсина типа А для медицинского применения на культуре клеток. Традиционно это тестирование проводилось на мышах при помощи метода количественного определения показателя LD₅₀ (количество препарата, вызывающее гибель 50% мышей при внутрибрюшинном введении), который принят в качестве «золотого стандарта». Учеными из Национального института биологических стандартов и контроля (The National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)¹⁰ был разработан метод определения специфической активности на культуре клеток (сell based potency assay, CBPA). Метод CBPA полностью заменил использование животных для оценки качества специфической активности препаратов ботулинического токсина типа А для медицинского применения в странах ЕС и США. В CBPA используется клеточная культура, которая высоко чувствительна к воздействию малых доз ботулинического нейротоксина (4–9 нг/флакон). Зачастую каждая компания-производитель самостоятельно подбирает и/или выращивает клеточную культуру под свой продукт. Это значимо увеличивает стоимость анализа и ограничивает воспроизводимость метода. В настоящее время, несмотря на активное внедрение в производственную практику методов in vitro, замены метода количественного определения показателя LD₅₀ на мышах пока не произошло. Метод «золотого стандарта» не исключен из ЕФ¹¹, и любой альтернативный метод in vitro должен быть валидирован относительно него.

Следующим образцом отказа от использования животных в экспериментальных целях служит тест на аномальную токсичность, который был признан широким кругом исследователей устаревшим и неспецифичным методом в отношении некоторых препаратов (вакцины, иммунные сыворотки, биотерапевтические средства, аллергены и др.). Экспертный комитет ВОЗ по биологической стандартизации (Expert Committee on Biological Standardisation, ECBS) и ЕФ, Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств США (Food and Drug Administration, FDA) и многие другие регуляторные органы исключили данный тест из своих требований в 2018 г.¹³ [10]. Однако, несмотря на это, результаты теста на аномальную токсичность по-прежнему запрашиваются регуляторными органами многих стран и/или тест используется производителями. Согласно проведенному опросу 80% респондентов осведомлены, что ВОЗ отменила требование проводить тест на аномальную токсичность, вместе с тем 57% от общего числа опрошенных по-прежнему проводят его. По мнению специалистов ВОЗ и NC3Rs такая ситуация связана с тем, что многие производители реализуют свою продукцию в нескольких регионах, где необходимо проведение данного теста в соответствии с требованиями национального законодательства [5].

Применение принципов 3Rs для оценки качества вакцины от полиомиелита является еще одним успешным примером. В течение многих лет в испытаниях вакцины на нейровирулентность использовали макак и мартышек как единственных животных, которые восприимчивы к вирусу полиомиелита. В 90-х годах прошлого столетия была выведена трансгенная мышь, чувствительная к этому вирусу¹⁴ [11][12]. Специалистами NIBSC, ВОЗ и другими регуляторными лабораториями были проведены испытания, подтвердившие, что этот тип мышей может быть использован для тестирования вакцин от полиомиелита. Эти исследования в конечном итоге привели к утверждению нового метода испытания вакцины на нейровирулентность на мышах¹⁵ [13–15].

Замена методов оценки специфической активности ДА и СА в тестах на животных серологическими методами является продолжением концепции 3Rs, чему уделяется большое внимание во всем мире¹⁶. Например, в Институте сывороток Индии (Serum Institute of India) для оценки специфической активности АКДС-вакцины традиционный метод летального заражения на морских свинках/мышах был заменен методами оценки специфической активности ДА на культуре клеток Vero и СА — методом иммуноферментного анализа (ИФА), которые были разработаны в течение трех лет. Это позволило сократить количество используемых в лабораторных исследованиях морских свинок на 85% (с 232 до 30)¹⁷ [4].

Эксперты ECBS, ЕФ, FDA поддерживают замену теста по определению пирогенности на кроликах на ЛАЛ-тест (реакция лизата амебоцитов с эндотоксином)¹⁸ для идентификации бактериального эндотоксина.

EDQM активно развивает программы¹⁹ по замене и усовершенствованию методов in vivo [16]. В период с 2016 по 2022 гг. был организован проект VAC2VAC (Vaccine batch to vaccine batch comparison by consistency testing)²⁰. Целью проекта являлась разработка методов in vitro для исследования вакцин, создание процедур и нормативной базы для взаимного принятия вакцин, оценка и оптимизация методов оценки качества вакцин для рутинного контроля. Одно из направлений проекта VAC2VAC было посвящено разработке клеточного метода определения пирогенов — тест активации моноцитов (МАТ), который заменяет не только тест на кроликах, но и ЛАЛ-тест. Метод МАТ позволяет определять все виды пирогенных примесей и обладает высокой чувствительностью (0,004 ЕЭ/мл, ЕЭ — единица эндотоксина) [17]. Эта работа убедила Комиссию ЕФ (The European Pharmacopoeia Commission, EPC) принять решение об исключении метода определения пирогенности на кроликах из монографий ЕФ. С 1 июля 2025 г. метод будет исключен из 57 монографий²¹.

Таким образом, EDQM поощряет применение методов, не связанных с использованием животных. Международное сотрудничество является ключевым элементом для внедрения принципов 3Rs в практику. Для успешного освоения новых методов необходимы не только взаимодействие между производителями и регуляторными органами, но также обмен стандартными процедурами и участие в многоцентровых валидационных исследованиях.

Применение принципов 3Rs в контексте оценки качества АКДС-вакцины

Дифтерийный и столбнячный анатоксины, а также вакцина от коклюша являются компонентами ряда вакцин календаря прививок. АКДС-вакцину производят с 1948 г. [18], а методы производства и контроля качества вакцины эволюционировали вместе с развитием науки и технологий. В настоящее время для контроля качества АКДС-вакцины в мире используются традиционные методы in vivo и альтернативные in vitro, которые применяются на разных стадиях производственного цикла при условии, что доказана чувствительность метода in vitro относительно метода in vivo для частного препарата. Альтернативный метод должен быть одобрен регуляторным органом.

В таблице 2 представлены результаты сравнительного анализа количества лабораторных животных, требуемых для контроля качества вакцины традиционными и современными альтернативными методами на различных стадиях производства.

Традиционными методами оценки специфической безопасности и реверсии токсичности (полнота инактивации токсина) ДА являются кожные тесты. Основанием для замены теста на специфическую безопасность послужили результаты исследования, которые доказали, что чувствительность культуры клеток Vero к дифтерийному токсину выше, чем у животных. Пределы обнаружения токсина in vitro зависят от применяемой методики и находятся в диапазоне от 10 до 100 пг/мл, что на порядок выше предела обнаружения метода in vivo [19]. Поскольку для определения реверсии токсичности должны применяться высокочувствительные методы, позволяющие обнаруживать очень малые количества токсина, то оба теста объединили.

Тест на реверсию токсичности СА был исключен. Это решение было основано на данных о стабильности СА. За долгую мировую практику производства ни разу не было зафиксировано реверсии токсичных свойств.

После сорбции ДА и СА на адъювант (гель алюминия) испытания на специфическую безопасность считаются избыточными, поэтому они были исключены как на данной стадии производства, так и в готовом продукте.

Эксперты EDQM инициировали исследования по оценке альтернативного серологического испытания цельноклеточного коклюшного компонента с целью замены метода определения специфической активности in vivo. Используемый метод основан на интрацеребральном введении летальных доз тест-штамма Bordetella pertussis (метод Кендрик). Исследования были прекращены²², так как анализ полученных результатов не продемонстрировал достаточной точности и воспроизводимости.

Для контроля качества бесклеточных коклюшных вакцин²³ на стадии получения антигенов и их сорбции на адъювант применяются в основном иммунохимические методы (ракетный электрофорез, радиальная иммунодиффузия), ЛАЛ-тест и высокоэффективная жидкостная хроматография. Для оценки остаточных количеств коклюшного токсина и реверсии токсичности коклюшного анатоксина (в таблице 2 обозначен как тест на специфическую безопасность) был применен тест на гистамин-сенсибилизирующий фактор. С 2020 г. он был заменен²⁴ на тест in vitro с использованием культуры клеток СНО²⁵ (CHO cell clustering assay). В готовой вакцине контроль специфической безопасности не предусмотрен.

Специфическую активность каждого компонента вакцины контролируют на нескольких стадиях производственного цикла: до розлива, на стадии готового продукта после розлива, а также при лицензировании/выпуске серии вакцины. Комитетом экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов установлены требования к показателю специфической активности этих анатоксинов в прививочной дозе (0,5 мл): ≥30 МЕ для ДА, ≥40 МЕ (в тесте на мышах 60 МЕ) для СА²⁶ и 4 МЕ — для цельноклеточного коклюшного компонента²⁷. Для бесклеточных коклюшных компонентов международных норм не установлено, специфическую активность оценивают методом ИФА.

Большее количество животных (табл. 2) требуется для испытаний традиционными методами in vivo. Для оценки безопасности и токсичности компонентов вакцины внедрение альтернативных методов позволило практически полностью сократить количество животных в эксперименте. Для определения специфической активности ДА и СА количество животных не стало меньше: от 64 до 75 морских свинок (ДА) и 64–112 мышей или 76 морских свинок (СА). Количество и вид животных зависят от методики оценки, принятой в стране-производителе вакцины. Несмотря на активное внедрение альтернативных методов для определения специфической активности в практику производителей, значительного сокращения количества животных в эксперименте не достигнуто. Поскольку основным принципом применения концепции 3Rs является снижение страданий животных, а именно использование ГКТ, некоторые производители сократили количество используемых животных на стадии готового продукта путем применения метода однодозовых разведений для оценки специфической активности ДА и СА. Существенно сократить количество экспериментальных животных удалось в случае производства вакцины, содержащей бесклеточный коклюшный компонент: при помощи метода ИФА в образцах сыворотки крови мышей определяют титр антител к каждому антигену, присутствующему в вакцине.

Таким образом, большее количество животных необходимо для оценки специфической активности. Поэтому практический интерес для исследователей представляет анализ основных различий между альтернативными методами и традиционными методами «золотого стандарта». Далее будут проанализированы методы оценки специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов в АКДС-вакцине.

Оценка специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов

Специфическую активность ДА и СА в вакцинах определяют путем сравнения с соответствующей референс-вакциной, откалиброванной по международному стандарту. Методы, которые применяют для контроля качества вакцины, можно разделить на две группы²⁸: методы с введением токсинов животным и серологические методы с определением титра специфических антител (рис. 1).

Каждый метод включает в себя два этапа: иммунизация, затем либо введение провокационных доз токсина, либо забор крови у животного для последующего определения уровня антител. Поскольку методы летального заражения являются «золотым стандартом» то все альтернативные методы должны быть валидированы относительно них²⁹. Для подтверждения корреляции показателей иммунного ответа (специфическая активность), определяемых по выживаемости при летальном заражении животных, и результатами серологических методов требуется параллельное изучение иммунного ответа двумя способами. При этом необходимо отметить, что требования к количественному значению показателя иммунного ответа, определяемого серологическим методом, не установлены.

Методами летального заражения специфическую активность СА и ДА определяют по их способности защищать иммунизированных животных от заражения соответствующим токсином и выражают в количестве Международных единиц (МЕ) активности, содержащихся в 1 мл или в прививочной дозе (0,5 мл).

Метод кожно-некротических проб, несмотря на введение токсина морским свинкам, считается соответствующим принципам 3Rs, поскольку животные не гибнут от дифтерийной интоксикации. В данном методе появление эритемы или некроза после внутрикожного введения токсина служит в качестве ГКТ, что минимизирует страдания животных. В ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России проводили работы по валидации метода кожно-некротических проб и было установлено, что его использование в рутинной практике сопряжено с рисками получения недостоверных результатов в сравнении с методом летального заражения [20].

Методы определения специфической активности применяют главным образом в двух вариантах: а) испытание с тремя разведениями позволяет определить количество единиц активности в прививочной дозе препарата; б) испытание с одним разведением позволяет провести сравнительную оценку активности прививочной дозы и референс-вакцины. Активность испытуемой вакцины считается удовлетворительной, если ее введение в организм вызывает значительно более высокий уровень ответа, чем референс-вакцина (точный критерий Фишера односторонний, р≤0,05). Из всех описанных выше методов только метод кожно-некротических проб не может быть выполнен с одним разведением.

Многие сторонники альтернативных серологических методов [4][21–23] отмечают, что факторами, побуждающими отказаться от традиционных методов с введением токсинов, являются длительность и сложность их постановки, потребность в большом количестве животных разных видов, вариабельность результатов из-за нестандартности животных, необходимость работы с патогенным материалом при заражении животных, а также тщательного соблюдения норм биоэтики при работе с лабораторными животными. В связи с этим задача максимального сокращения использования животных для оценки биологических препаратов важна не только по этическим соображениям, но научно и практически обоснована: животные дорогостоящи и не могут быть стандартизованы.

Ниже изложены результаты сравнительной оценки альтернативных методов и методов летального заражения для определения специфической активности ДА и СА по количеству животных, материальным и временным затратам и затратам прочих ресурсов (табл. 3 и табл. S1, опубликована на сайте журнала³⁰). Все рассматриваемые методы являются фармакопейными³¹.

ОБСУЖДЕНИЕ

В российской практике внедрение принципов 3Rs осуществлено введением в 2010 г. в метод летального заражения методики с одним разведением в соответствии с требованиями ЕФ и ВОЗ. Это позволило значительно сократить количество животных, используемых в тестах специфической активности ДА и СА, — с 75 до 25 морских свинок и с 108 до 48 мышей соответственно.

Зарубежные авторы, обсуждая альтернативные методы тестирования специфической активности АКДС-вакцины, отмечают их значительные преимущества перед традиционными методами: высокую точность, экономичность и, самое важное, — сокращение количества используемых животных [21–23].

Основываясь на результатах анализа данных, представленных в таблицах 3 и S1, можно рассмотреть, насколько принципы 3Rs реализованы в альтернативных методах оценки специфической активности ДА и СА.

Замена: сравнительная оценка методов определения специфической активности дифтерийного и столбнячного компонентов АКДС-вакцины показывает, что основными методами контроля остаются методы in vivo. Постановка альтернативных методов требует использования животных, что, в свою очередь, не дает дополнительных преимуществ с точки зрения сокращения продолжительности испытаний и количества животных в испытании.

Сокращение: для вакцин, содержащих ДА и СА, принцип реализуется в испытаниях с одним разведением.

Усовершенствование: использование гуманных конечных точек. В серологических методах — это неклиническая конечная точка, в которой производят забор крови под инъекционным наркозом для определения титра защитных антител, после чего гуманно умерщвляют животное. Таким образом, исключается стадия заражения токсином, который провоцирует клиническую картину дифтерии или столбняка, где конечной точкой является смерть или тяжелые клинические проявления в виде паралича вследствие столбнячной интоксикации.

Проведенный анализ демонстрирует, что все альтернативные серологические методы требуют большего количества дорогостоящих стандартных образцов, дополнительных реактивов, специального дорогостоящего оборудования, особенно для теста с использованием клеточной культуры, и программного обеспечения по сравнению с методом «золотого стандарта». Необходимо также учитывать, что постановка технически сложных методов требует наличия персонала, обладающего определенными навыками и компетенциями для забора крови из сердца (или vena saphena), пробоподготовки образцов крови, постановки ИФА и МТТ-теста, работы с клеточной культурой и навыками статистической обработки данных. Многоэтапность альтернативных методов может повлечь за собой появление множественных ошибок. Например, выполнение теста на клеточной культуре связано не только с дополнительными финансовыми затратами, но и серьезными рисками: во-первых, все манипуляции необходимо проводить в асептических условиях; во-вторых, непосредственно перед каждым испытанием необходимо определять цитопатическую дозу дифтерийного токсина, потому что клеточная культура от серии к серии обладает значительной вариативной чувствительностью к токсину; в-третьих, для работы с клеточными культурами сотрудники должны обладать специальными навыками.

Таким образом, тезисы зарубежных авторов [21–23] о том, что испытания на животных являются более дорогими, трудоемкими и изменчивыми по сравнению с альтернативными, не подтверждаются. Ни один из рассмотренных альтернативных методов не уступает методу «золотого стандарта» по количеству животных, длительности испытания и экономичности. Только в методе ИФА исключена работа с токсинами и оптимизировано количество животных в эксперименте. ИФА позволяет одновременно оценить иммунный ответ к столбнячному и дифтерийному антигенам в образце сыворотки крови, взятого от одного животного.

Принципы 3Rs распространяются на все сферы жизнедеятельности современного человека, в том числе и на защиту окружающей среды от загрязнений. В последнее время научное сообщество активно обсуждает вопрос о необходимости снижения объема отходов лабораторного пластика. Среди основных предлагаемых стратегий — замена пластиковых лабораторных материалов (посуда, пипетки и др.) на металлические или стеклянные, вторичное использование после обработки (дезинфекция, мойка) и сокращение применения одноразового пластика в том случае, если не применимы первые две стратегии. Если исследования не позволяют отказаться от одноразовых пластиковых материалов, их следует сортировать и сдавать для переработки. Исследователи отмечают, что, хотя переработка и/или утилизация и создает загрязнение окружающей среды, это предпочтительнее, чем после дезинфекционной обработки утилизировать пластиковые материалы как отходы³².

Анализ методов с точки зрения количества получаемых лабораторных отходов показал, что несомненными преимуществами обладают методы летального заражения: минимальное количество лабораторного пластика (шприцы, наконечники для дозаторов), возможность использовать стеклянные флаконы и серологические стеклянные пипетки для приготовления разведений, а животные утилизируются с органическим остатком. Для альтернативных методов применение стратегий снижения лабораторных отходов представляется затруднительным ввиду необходимости использования микропланшетов для ИФА, культуральных планшетов и других одноразовых материалов. Эти методы, особенно метод с использованием культуры клеток, предполагают применение некоторого количества токсичных растворов, на обеззараживание и утилизацию которых необходимы дополнительные ресурсы.

Из приведенного выше анализа современных альтернативных методов определения специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов в АКДС-вакцине выявлены преимущества и недостатки. Так, метод ИФА имеет несомненные преимущества: позволяет сократить количество животных в эксперименте благодаря возможному определению антител к двум антигенам в образцах крови, взятых от одного животного; не используются токсины; не требуются особые лабораторные условия для выполнения анализа; дешевле относительно других альтернативных методов.

Методы с использованием клеточной культуры Vero и метод ингибирования связывания токсина (ToBI) имеют ряд существенных недостатков по сравнению с ИФА: длительность и сложность постановки, необходимость работы с токсинами.

Из недостатков трех рассмотренных альтернативных методов можно выделить следующие: необходимость приобретения значительного количества критических реагентов и стандартных образцов, специального оборудования и программного обеспечения; наличие персонала, обладающего специальными навыками и компетенциями; утилизация большого объема лабораторных отходов классов Б и Г.

Проведенный анализ современных методов определения специфической активности компонентов АКДС-вакцины позволяет заключить, что с помощью метода летального заражения («золотой стандарт») можно быстрее и с меньшей трудоемкостью оценить протективные свойства вакцины по сравнению с альтернативными методами. Таким образом, серологические методы для определения специфической активности компонентов АКДС-вакцины можно рассматривать как более трудоемкие, длительные по времени и требующие вовлечения большего числа специалистов.

В то же время нельзя не отметить преимущества альтернативных методов, применяющихся в процессе производственного цикла, для оценки реверсии токсичности и безопасности АКДС-вакцины. Замена контроля на более чувствительные к дифтерийному токсину культуры клеток Vero и отказ от тестирования СА значительно упрощают процедуры и ведут к сокращению количества лабораторных животных в исследованиях.

Для внедрения в российскую производственную и лабораторную практику новых методов необходимо проведение их валидации при активном сотрудничестве исследовательских лабораторий, производителей и государственных регуляторных органов. В настоящее время продолжаются исследования по использованию ИФА для контроля качества АКДС-вакцины [24].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По сравнению с альтернативными методами определения специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов в АКДС-вакцине методы летального заражения являются самыми быстрыми и простыми в исполнении, не требуют дополнительного оборудования, программного обеспечения, критических стандартных образцов, реактивов и материалов, а также особых навыков персонала лаборатории.

При выборе альтернативных методов, ИФА — наиболее предпочтителен вследствие его экономичности, наименьшей сложности в исполнении и отсутствия необходимости использовать токсины в анализе. ИФА оптимален при изучении влияния антигенного состава комбинированных вакцин на специфическую активность отдельных антигенов, поскольку в образцах крови иммунизированного животного можно одновременно определять титры антител различной специфичности. Несомненно, подобное объединение процедур контроля специфической активности комбинированных вакцин на основе АКДС в одном серологическом тесте приведет к значительному сокращению количества животных в экспериментах.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещена таблица S1.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-2-156-169-table-s1

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.И. Комаровская — идея исследования, обработка и анализ данных литературы, написание текста рукописи, формулировка выводов исследования; О.В. Проскурина — оформление таблиц, работа с источниками литературы.

Additional information. Table S1 is published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-2-156-169-table-s1

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. E.I. Komarovskaya conceived the study idea, drafted the manuscript, and formulated the conclusions; O.V. Proskurina designed the tables, collected and analysed literature data.