Кандидатный препарат на основе модифицированных однодоменных антител для терапии ботулизма, вызванного ботулиническим токсином типа А

ВВЕДЕНИЕ

Ботулинические токсины (botulinum neurotoxin, BoNT) являются опасными природными токсинами, продуцируемыми бактериями рода Clostridium. Попадание BoNT в организм человека даже в небольших количествах (>0,5 нг/кг) вызывает ботулизм — тяжелое заболевание, характеризующееся острым симметричным нисходящим вялым параличом¹. В случае развития ботулизма необходима своевременная диагностика и ранняя терапия. Ежегодно в мире регистрируется около 1000 случаев ботулизма, 10% из которых являются летальными [1]. Ежегодно в Российской Федерации выявляется около 100–200 случаев ботулизма². В 2024 г. в России произошла вспышка ботулизма (более 400 заболевших)³.

Несмотря на то что ботулизм является хорошо описанным заболеванием с известной клинической картиной, его ранняя диагностика затруднена из-за относительно редкой встречаемости, а также симптомов, схожих с другими заболеваниями. Вследствие этого имеются сложности с началом ранней терапии и экстренной профилактики существующими средствами.

Основной метод лечения ботулизма — применение антитоксина ботулинического для нейтрализации свободно циркулирующего ботулотоксина. Существующие в настоящее время препараты антитоксина в виде сыворотки противоботулинической лошадиной являются универсальным доступным средством терапии. Однако применение препаратов вызывает ряд побочных эффектов, включая аллергические реакции и сывороточную болезнь [2]. Кроме того, для препаратов сыворотки могут возникать проблемы, связанные с вариацией показателей качества между партиями, а также вирусной безопасностью. Таким образом, актуальной задачей является разработка эффективных антитоксинов против BoNT с применением современных биотехнологических подходов, в том числе моноклональных и однодоменных антител.

В течение последних двух десятилетий были разработаны терапевтические препараты на основе моноклональных антител [3–5]. Такие препараты имеют значительный потенциал для эффективной нейтрализации токсинов. В настоящее время существуют несколько препаратов антител против различных токсинов, например препараты актоксумаб и безлотоксумаб, специфичные к токсинам бактерий Clostridium difficile.

Перспективным направлением является разработка препаратов однодоменных антител (variable heavy chain domain of a heavy chain antibody, VHH), поскольку такие препараты характеризуются повышенной стабильностью, сниженной иммуногенностью, способностью связываться с труднодоступными эпитопами, а также проникать через гематоэнцефалический барьер [6][7]. К недостаткам однодоменных антител можно отнести низкую длительность циркуляции. Использование различных модификаций антител, например связывание с человеческим Fc-фрагментом, позволяет улучшить фармакокинетические параметры антитела и обеспечить эффекторные функции в организме [8][9]. В связи с этим актуальным представляется создание препарата на основе однодоменных антител для эффективной защиты в отношении BoNT, включающее в себя этапы разработки оптимальной технологии получения препарата высокой чистоты и оценки качества, а также проведения доклинических исследований эффективности препарата.

Ранее авторами было получено однодоменное антитело B11, слитое с Fc-фрагментом IgG1 человека (B11-Fc) [10], а также клеточная линия СНО, стабильно продуцирующая антитело B11-Fc (клон В7). Описанный метод не предусматривал большой объем наработки препарата, в связи с чем потребовалась оптимизация процесса культивирования клона-продуцента и условий очистки антитела B11-Fc, которая проводилась в рамках данной работы.

Цель работы — оптимизация лабораторной технологии получения и доклинические исследования эффективности препарата на основе однодоменного антитела, модифицированного Fc-фрагментом IgG1 человека (B11-Fc), для терапии и экстренной профилактики ботулизма.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение однодоменного антитела B11-Fc

Получение модифицированного однодоменного антитела B11-Fc, специфичного к ботулиническому токсину типа А (botulinum neurotoxin type A, BoNT/A), а также клеточной линии, продуцирующей антитело B11-Fc, проводили, как описано ранее [10]. Подбор оптимальных условий культивирования выполняли на основе подхода, описанного ранее [11]. Для проведения культивирования использовали клетки линии CHO, полученной из коллекции ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России). Применяли питательные среды SFM4CHO и ActiPro (Cytiva, США), подпитки Cell Boost 5 и Cell Boost 7a/7b (Cytiva, США). Культивирование клеток осуществляли в колбах Эрленмейера различных объемов (Corning, США) при 37 °C, 5% CO₂ и постоянном перемешивании 85–100 об/мин в инкубаторе Multitron (Infors HT, Швейцария). Концентрацию клеток и их выживаемость анализировали с использованием счетчика клеток Cedex HiRes Analyzer (Roche, Швейцария) в соответствии с инструкцией производителя.

Измерение концентрации антитела в культуральной жидкости на всех стадиях работы проводили с использованием системы биослойной интерферометрии (bio-layer interferometry, BLI) Octet RED96 (ForteBio, США) и биосенсоров Ni-NTA (ForteBio, США) в соответствии с протоколом производителя в режиме кинетического измерения. Метод BLI также использовали для установления равновесных констант диссоциации антитела с Fc-рецепторами. В ходе измерения определяли параметр «Baseline» (в течение 30 с) в кинетическом буфере (150 мМ NaCl, 20 мМ натрия фосфат, натрия азид, рН 7,2), далее белки FcRn, CD16a, CD16b, CD32a, СD32b, γRI загружали на сенсоры в концентрации 30 мкг/мл (в течение 60 с). Затем VHH-Fc вносили в различных молярных концентрациях (500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,62; 7,81; 0 нМ) в кинетическом буфере на 300 с. Диссоциацию осуществляли в кинетическом буфере в течение 300 с. Анализ полученных данных выполняли с использованием программного обеспечения Octet Data Analysis 10.0 (ForteBio, США).

Хроматографическую очистку антител проводили в несколько стадий с использованием аффинной, анионообменной и мультимодальной хроматографии. Для аффинной хроматографии применяли хроматографическую систему ÄKTA Pure 25 (Cytiva, США) и колонку, содержащую сорбент MabSelect SuRe (Cytiva, США). В качестве связывающего буфера использовали раствор 150 мМ NaCl, 15 мМ Na₂HPO₄, 5 мМ NaH₂PO₄, 0,1% полисорбат 80, pH 7,2; в качестве элюирующего — раствор 200 мМ глицина (pH 2,5) с 0,1% полисорбатом 80. Для анионообменной хроматографии применяли колонку Sartobind Q Nano 3 мл (Sartorius, Германия). Очистку проводили в режиме проскока, в качестве буфера использовали раствор 150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 6,8. Дополнительную очистку выполняли с помощью мультимодальной хроматографии с использованием керамического гидроксиапатита CHT Type I (Bio-Rad, США). Для предварительного уравновешивания сорбента использовали раствор, содержащий 75 мМ Na₂HPO₄, 25 мМ NaH₂PO₄, 6 ppm CaCl₂, pH 7,5. Далее колонку уравновешивали раствором, содержащим 150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 6,8. Затем проводили нанесение образца (pH 6,8) и промывание раствором, содержащим 150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 6,8. Элюирование целевых фракций осуществляли раствором, содержащим 150 мМ NaCl, 15 мМ Na₂HPO₄, 5 мМ NaH₂PO₄, pH 7,2.

Очистку препарата от вирусов проводили путем вирусной инактивации и фильтрации. Вирусную инактивацию выполняли после стадии аффинной очистки путем инкубирования фракций антител при комнатной температуре в течение 30 мин в элюирующем буфере (pH 3,0). Далее pH доводили до 7,2–7,4 раствором трис-HCl (1М, pH 9,0). После последней стадии хроматографической очистки антител проводили вирусную фильтрацию с помощью фильтров Virosart HF 200 см² (Sartorius, Германия).

Для концентрирования препарата выполняли тангенциальную фильтрацию с помощью картриджа Hollow Fiber 30 кДa 850 см² (GE Healthcare, США) в буфере 20 мМ Na₂HPO₄×12H₂O, 0,01% полисорбат 80, 150 мМ NaCl, pH 7,2. Далее осуществляли конечную фильтрацию с использованием капсульных фильтров Sartopore 2, 0,2 мкм (Sartorius, Германия).

Степень чистоты образцов препарата антител после очистки анализировали с применением методов электрофореза и ВЭЖХ. Электрофорез в полиакриламидном геле проводили с использованием гелей Mini-Protean TGX Stain-Free Precast Gels (Bio-Rad, США). Денатурацию образцов осуществляли в буфере с 2-меркаптоэтанолом (Sigma, США) при 95 °C в течение 10 мин. ВЭЖХ проводили с использованием системы Vanquish Flex UHPLC Systems (Thermo Scientific, США) и колонки BioSep SEC-s3000 5 мкм (Phenomenex, США) в соответствии со стандартной методикой [12]. Пробу (20 мкл) наносили в изократическом режиме при скорости потока 0,5 мл/мин.

Изучение гликанового профиля осуществляли с помощью ВЭЖХ (колонка Accucore 150 Amide HILIC 2,5 мкм, 150 мм, Thermo Scientific, США) и стандартов гликанов AdvanceBio (Agilent, США).

Измерение размера частиц в растворе выполняли методом динамического светорассеяния с помощью оборудования Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания) в соответствии с инструкцией производителя.

Исследование эффективности препарата однодоменного антитела B11-Fc in vivo

Эксперименты проводили на мышах-самках линии BALB/c (масса 18–20 г), ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России, филиал «Андреевка». Исследования проводились в соответствии с протоколом, утвержденным на заседании биоэтической комиссии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (протокол № 16 от 08.02.2019). Исследования выполняли согласно международным и национальным требованиям⁴. Перед началом экспериментов предварительно стерилизовали воду, подстилку, корм и клетки. Животных содержали в условиях свободного доступа к корму и воде (ad libitum).

Ботулинический токсин типа А получали с помощью культивирования штамма Clostridium botulinum А98 и дальнейшей хроматографической очистки, как описано ранее [10].

Предварительно определяли LD₅₀ BoNT/A при внутрибрюшинном (в/б) введении нескольких доз токсина (интервал между дозами — 1,2 раза). На основании установленного значения LD₅₀ рассчитывали дозы в последующих экспериментах. При расчете доз LD₅₀ BoNT/A при внутрижелудочном (в/ж) введении использовали значения доз, соответствующие LD₅₀ для в/б введения.

При моделировании интоксикации BoNT/A клиническую картину у мышей устанавливали при в/б введении, n=5, или в/ж введении, n=10. Тяжесть токсических признаков оценивали по балльной шкале по следующим признакам: легкое (1 балл) или умеренное (2 балла) абдоминальное дыхание, тяжелое абдоминальное дыхание и/или агональное дыхание (3 балла); слюнотечение и вялость (1 балл), слабость (2 балла) или полный паралич тела (отсутствие рефлексов, 3 балла). Животных, набравших 12 баллов при последовательных наблюдениях, подвергали эвтаназии в случае, если гибель не происходила ранее.

Для исследования протективного действия антитела B11-Fc проводили распределение животных по группам (контрольные, опытные группы, n=5). Токсин BoNT/A вводили в/б в дозах 5–100 LD₅₀. Антитело B11-Fc вводили внутримышечно (в/м) в дозах 0,03–1,2 мг/кг.

Для изучения фармакокинетики препарат B11-Fc вводили внутривенно (в/в) в дозе 0,6 мг/кг и оценивали его концентрацию через 1, 4, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 504, 672 ч в опытных группах мышей (n=3). Определение концентрации B11-Fc в образах сыворотки крови мышей проводили с использованием набора IgG общий-ИФА-БЕСТ (АО «Вектор-Бест», Россия).

Для исследования специфической активности антитела B11-Fc распределяли животных по группам (контрольные, опытные группы, n=10). Токсин BoNT/A вводили в/б и в/ж в дозах 5 LD₅₀ и 12000 LD₅₀ соответственно. Антитело B11-Fc вводили внутримышечно (в/м) в дозе 0,6 мг/кг.

Статистическая обработка результатов

Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2010, GraphPad Prism 9.0 (США) и ELISA Master («АлкорБио», Россия). Для оценки межгрупповых различий значений титра антител, выживаемости животных и значений исследуемых характеристик использовали критерий Краскела — Уоллиса. Попарное сравнение значений в экспериментальных группах с контрольными проводилось с использованием критерия Даннета. Достоверность отличий оценивали с помощью t-критерия и логарифмического рангового теста. Минимальный уровень значимости составлял 5% (p<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка лабораторной технологии получения препарата однодоменного антитела B11-Fc

Оптимизация процесса культивирования клона-продуцента В7. Подбор условий для оптимизации культивирования клона-продуцента с целью увеличения выхода B11-Fc проводили в колбах Эрленмейера объемом 25 мл. Клетки линии СНО, предварительно адаптированные к питательным средам SFM4CHO или ActiPro, высевали в концентрации 1,0×10⁶ клеток/мл. При достижении плотности более 3,0×10⁶ клеток/мл проводили добавление подпиток CellBoost 5 или CellBoost 7a и 7b по схеме, представленной в таблице 1.

Проведенные исследования показали, что концентрация клеток СНО при использовании среды для культивирования ActiPro по сравнению со средой SFM4CHO была более высокой. При этом в случае применения комбинации среды ActiPro и подпиток CellBoost 7a и 7b показатели концентрации клеток, а также концентрации антитела в среде были максимальными — 14,9×10⁶ клеток/мл и 608 мкг/мл соответственно. В связи с этим данная комбинация среды и подпиток была выбрана для дальнейшего культивирования клона-продуцента антитела B11-Fc.

Достигнутые показатели культивирования коррелировали с данными, полученными авторами ранее [11], что указывает на оптимальные свойства среды ActiPro для обеспечения высоких темпов роста клеток и продукции антител.

Оптимизация условий очистки антитела B11-Fc. Культивирование клона-продуцента B7 проводили в соответствии с подобранной схемой в течение 9 сут. Стратегия очистки препарата антител включала в себя несколько этапов: аффинная, анионообменная и мультимодальная хроматография. На первом этапе очистки антител применяли метод аффинной хроматографии с использованием сорбента MabSelect SuRe. Проводили подбор оптимального состава элюирующего буфера. Было установлено, что при элюировании антител с колонки буфером на основе 20 мМ цитрата натрия (pH 2,8) наблюдалась агрегация антител. При использовании в качестве элюента раствора 200 мМ глицина (pH 2,5) и 0,1% полисорбата 80 агрегация практически отсутствовала, в связи с чем данный буфер был выбран в качестве элюирующего.

После этапа аффинной хроматографии осуществляли вирусную инактивацию путем выдерживания элюата при pH 3,0 в течение 30 мин.

Следующий этап хроматографической очистки B11-Fc проводили с использованием анионообменной хроматографии на мембранном адсорбере Sartobind Q Nano для удаления остаточных белков и ДНК клеток СНО, а также белка А. После этого этапа очистки выход очищенного антитела составил около 95% от первоначального уровня.

Дополнительный этап хроматографической очистки осуществляли с помощью керамического гидроксиапатита первого типа 40 мкм CHT Type I. Использование хроматографии данного типа позволило достигнуть высокой чистоты препарата B11-Fc и избавиться от агрегатов (рис. 1, опубликован на сайте журнала⁵). Выход очищенной фракции антитела составил 85% от исходного уровня.

После финальной стадии очистки проводили вирусную фильтрацию с использованием фильтров Virosart HF 200 см². Концентрирование препарата осуществляли до концентрации 3,0 мг/мл при помощи тангенциальной фильтрации с помощью картриджа Hollow Fiber 30 кДa 850 см². Далее проводили конечную фильтрацию с помощью капсульных фильтров Sartopore 2, 0,2 мкм.

Таким образом, в условиях оптимизации процесса культивирования клона-продуцента В7 удалось повысить выход однодоменного антитела B11-Fc, а разработка схемы многостадийной хроматографической очистки позволила увеличить конечный выход антитела до значений — 500 мкг c 1 мл культуральной жидкости.

Оценка степени чистоты и основных характеристик препарата однодоменного антитела B11-Fc

При оценке содержания примесей в препарате с использованием ВЭЖХ было показано наличие одного целевого пика, который соответствовал мономерной форме антитела B11-Fc (около 99%), а также отсутствовали пики примесных белков (рис. 2).

Определение размера частиц в растворе препарата антител проводили с использованием метода динамического светорассеяния, что позволяет не только определить размер молекул и наличие их олигомеров, но и детектировать более крупные агломераты частиц, которые не определяются методом электрофореза, а также не могут быть обнаружены методом ВЭЖХ из-за их задержки на префильтрах хроматографической системы. Было показано присутствие одного основного пика, соответствующего молекулам со средним диаметром 7,85 нм, что согласуется со средним размером молекул VHH-Fc (рис. 3).

Изучение гликанового профиля препарата B11-Fc показало, что в зависимости от серии содержание высокоманнозилированных форм (Man5) составляло от 1 до 5% (табл. 2, опубликована на сайте журнала⁶). Указанный уровень значений показателя может свидетельствовать о возможности длительной циркуляции в организме [13]. Низкий уровень содержания высокогалактозилированных форм (G2+G2, 0%) позволяет предположить низкую иммуногенность препарата [14].

Поскольку препарат однодоменного антитела B11-Fc содержит Fc-фрагмент, необходимо изучение его взаимодействия с соответствующими рецепторами для оценки потенциальной роли в иммунологических реакциях [15]. Эти взаимодействия могут воздействовать на некоторые популяции иммунных клеток, а также влиять на поглощение, процессинг и представление антигена. Для изучения функциональной активности Fc-фрагмента проводили анализ взаимодействия с белками человека (FcRn, CD16a, CD16b, CD32a, СD32b, γRI), являющимися мишенями связывания с Fc-фрагментом человеческих иммуноглобулинов. Было показано, что антитело B11-Fc связывается с Fc-рецепторами человека с высокой аффинностью; значения K_D представлены в таблице 3. Указанные характеристики антител могут способствовать усилению фагоцитарной активности моноцитов и макрофагов [16]. Высокая аффинность B11-Fc к FcRn может свидетельствовать о возможности длительной циркуляции антитела в организме [17].

Исследование эффективности антитела B11-Fc in vivo

Моделирование интоксикации ботулиническим токсином типа А. На первом этапе исследования проводили оценку картины интоксикации при различных способах введения токсина BoNT/A. При в/б введении токсина мышам опытных групп (n=5) в дозах 5 или 10 LD₅₀ уже через 3 ч наблюдалась острая картина интоксикации с развитием симптомов умеренной тяжести (7 из 12 баллов) — абдоминальное и агональное дыхание, спазм диафрагмы и прилегающих мышц живота, что соответствовало литературным данным [18]. Летальность регистрировали спустя 7–8 ч (рис. 4А, опубликован на сайте журнала⁷). Таким образом, при в/б введении токсина картина интоксикации развивалась стремительно, что не вполне соответствует длительности развития токсических симптомов у человека (12–36 ч после воздействия токсина)⁸.

Так как наиболее частой причиной интоксикации у людей являются пищевые отравления, то на следующем этапе работы проводили моделирование интоксикации у мышей (n=10) при в/ж введении BoNT/A в дозах 3000, 6000, 12000 и 18000 LD₅₀, выбранных в соответствии с литературными данными [18]. Показано, что при в/ж введении токсина в дозах 12000 и 18000 LD₅₀ летальность регистрировалась через 10 и 24 ч соответственно (рис. 4В, опубликован на сайте журнала⁹). При использовании более низких доз летального эффекта не наблюдали. Для оценки специфической активности антитела B11-Fc на модели интоксикации мышей при в/ж введении BoNT/A была выбрана доза 12000 LD₅₀.

Изучение протективного действия антитела B11-Fc. Для подбора протективной дозы B11-Fc использовали острую модель интоксикации при в/б введении токсина. При дозе 10 LD₅₀ BoNT/A и последующем незамедлительном в/м введении антитела B11-Fc в различных концентрациях была показана полная защита мышей от летального эффекта токсина при дозах антитела, равных 1,2 и 0,6 мг/кг (рис. 5A). Для дальнейшей работы была выбрана доза антитела 0,6 мг/кг как минимальная для обеспечения полной защиты от летального токсического эффекта BoNT/A.

Для оценки протективного действия антитела B11-Fc в выбранной дозе, мышам опытных групп (n=5) вводили (в/б) 5, 10, 20, 50 и 100 LD₅₀ BoNT/A, после чего незамедлительно вводили (в/м) B11-Fc. Был показан 100% протективный эффект антитела B11-Fc при введении токсина в дозах 5, 10 и 20 LD₅₀, 60% — при дозе 50 LD₅₀ и 30% — при дозе 100 LD₅₀ (рис. 5B).

Таким образом, была подобрана оптимальная протективная доза антитела B11-Fc, равная 0,6 мг/кг, обеспечивающая защиту мышей от острой интоксикации BoNT/A.

Ранее авторами было показано, что в отсутствии модификации антитела Fc-фрагментом протективная активность препарата была ниже (>5 мг/кг) [10]. Следовательно, введение Fc-фрагмента приводит к повышению протективной активности, что может быть обусловлено увеличением авидности антитела.

Исследование фармакокинетики антитела B11-Fc. На первом этапе проводили изучение фармакокинетики B11-Fc, определяя концентрацию препарата в сыворотке крови после в/в введения дозы 0,6 мг/кг (рис. 6А). На основе фармакокинетической кривой были рассчитаны основные параметры фармакокинетики: максимальная концентрация, C_max — 1,22 мкг/мл; время достижения максимальной концентрации, T_max — 1,0 ч; площадь под фармакокинетической кривой «концентрация–время», AUC_0-t — 784,55 мкг/мл×ч; период полувыведения, T_1/2 — 46,4 ч.

Изучение специфической активности антитела B11-Fc в различных режимах применения. Исследование эффективности B11-Fc проводили в двух режимах его применения: профилактическом и терапевтическом.

Для оценки профилактического эффекта антитела мышам опытных групп (n=5) вводили в/м B11-Fc в дозе 0,6 мг/кг и далее через 7, 14, 21 и 28 сут вводили в/б токсин BoNT/A в дозе 5 LD₅₀. Показано наличие защитного профилактического эффекта B11-Fc при последующем введении токсина на 7, 14 и 21 сут (рис. 6В). Однако защитный эффект отсутствовал в случае введения токсина на 28 сут после применения B11-Fc, так же как и в контрольной группе (без введения B11-Fc).

Таким образом, полная защита мышей охранялась до 21 сут и достигалась при концентрации антитела в крови 0,088 мкг/мл. Полученные данные об эффективности препарата в профилактическом режиме обусловлены, по-видимому, модификацией антитела Fc-фрагментом и увеличением периода его полувыведения, поскольку, как было показано авторами ранее, однодоменное антитело B11 без Fc-фрагмента обладает более низкой протективностью и очень коротким периодом полувыведения (< 1 ч) [10].

Для оценки эффективности антитела B11-Fc в терапевтическом режиме применения мышам опытных групп (n=10) вводили в/б токсин BoNT/A в дозе 5 LD₅₀ и затем проводили в/м введение антитела B11-Fc (доза 0,6 мг/кг) через 0, 2, 4 и 6 ч. Было показано наличие защитного терапевтического эффекта B11-Fc при его использовании одновременно с токсином (временная точка 0 ч) и спустя 2 ч (рис. 7A). В группе с применением B11-Fc через 4 ч после токсического воздействия показана 40% выживаемость мышей, а через 6 ч — защитный эффект отсутствовал.

Для изучения эффективности B11-Fc после в/ж введения токсина (доза 12000 LD₅₀) проводили в/м введение антитела в дозе 0,6 мг/кг через 12, 14, 16, 18 и 20 ч. В контрольной группе мышей (без лечения) умеренные симптомы интоксикации наблюдались через 14 ч, а летальность наступала спустя 24 ч после введения токсина. В группах мышей с введением B11-Fc через 12 и 14 ч после BoNT/A показана 100% выживаемость (рис. 7B). При использовании антитела через 16 и 18 ч выживаемость мышей в группах составила 60 и 50% соответственно. В группе с введением B11-Fc через 20 ч защитный эффект отсутствовал. Таким образом, показана возможность применения антитела B11-Fc для терапии интоксикации, вызванной воздействием токсина BoNT/A при его в/ж введении, до проявления симптомов ботулизма умеренной степени тяжести.

Представленные данные исследования позволяют заключить, что разработанный кандидатный препарат на основе модифицированных однодоменных антител обладает эффективностью в режимах терапии, экстренной профилактики и краткосрочной профилактики в течение 21 сут после введения.

ВЫВОДЫ

1. Проведена оптимизация условий культивирования клона-продуцента В7 и хроматографической очистки для получения кандидатного препарата для терапии ботулизма на основе модифицированного однодоменного антитела B11-Fc. Выход антител составил 0,5 г/л; степень чистоты — более 99%.
2. Изучение гликанового профиля B11-Fcпоказало содержание высокоманнозилированных форм от 1 до 5%, высокогалактозилированных форм — 0%. Средний размер частиц в растворе препарата — 7,85 нм.
3. Показана функциональная активность Fc-фрагмента препарата антитела, реализуемая за счет связывания с высокой аффинностью с различными типами Fc-рецепторов человека (FcRn, CD16a, CD16b, CD32a, СD32b, γRI).
4. Продемонстрирована эффективность препарата B11-Fc на различных моделях интоксикации мышей ботулиническим токсином BoNT/A — при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении, а также при разных режимах применения препарата — в профилактическом и терапевтическом.
5. Рассчитаны основные параметры фармакокинетики B11-Fc у мышей: C_max— 1,22 мкг/мл, T_max — 1,0 ч, AUC_0-t — 784,55 мкг/мл×ч, T_1/2 — 46,4 ч. Концентрация антител, обеспечивающая защиту от 5 LD₅₀ ботулотоксина, составила 0,088 мкг/мл.
6. Показан защитный эффект препарата B11-Fc в дозе 0,6 мг/кг при использовании для краткосрочной (до 21 сут) профилактики ботулизма (при в/б введении мышам токсина в дозе 5 LD₅₀), что достигается благодаря наличию у однодоменного антитела Fc-фрагмента.
7. Применение препарата B11-Fc в дозе 0,6 мг/кг эффективно для экстренной профилактики интоксикации и терапии пищевого ботулизма (при в/ж введении мышам токсина в дозе 12000 LD₅₀) до проявления симптомов средней тяжести.
8. Полученные результаты доклинических исследований кандидатного препарата на основе модифицированных однодоменных антител позволили перейти к проведению фазы I клинических исследований для оценки безопасности и переносимости препарата на здоровых добровольцах.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещены рисунки 1, 4 и таблица 2.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-591-fig1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-591-fig4

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-591-table2

Additional information. Figure 1, Figure 4, and Table 2 are published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-591-fig1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-591-fig4

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-591-table2

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.А. Деркаев — получение клона-продуцента антитела B11-Fc, анализ качества препарата, проведение биослойной интерферометрии, исследование эффективности препарата in vivo, интерпретация результатов, написание текста рукописи; Е.И. Рябова — оптимизация условий культивирования клона-продуцента, анализ качества препарата, исследование эффективности препарата; И.Б. Есмагамбетов — концепция и дизайн исследования, интерпретация результатов, редактирование текста рукописи; Д.В. Щебляков — дизайн генетической конструкции, экспрессирующей однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом, руководство исследованиями; А.Н. Носков — концепция исследования, получение и очистка ботулинического токсина А; И.Д. Виноградова — концепция исследования, изучение активности токсина; В.В. Прокофьев — оптимизация хроматографической очистки антитела, анализ качества препарата; Д.С. Полянский — культивирование клона-продуцента, оптимизация условий культивирования; Д.Ю. Логунов, А.Л. Гинцбург — руководство исследованиями, окончательное утверждение версии статьи для публикации.

Соответствие принципам этики. Исследования проводились в соответствии с протоколом, утвержденным на заседании биоэтической комиссии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (протокол № 16 от 08.02.2019).

Благодарности. Коллектив авторов выражает благодарность коллегам из ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, оказавшим помощь в выполнении исследования.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. A.A. Derkaev obtained a stable B11-Fc antibody producer clone, analysed the quality of the preparation, performed bio-layer interferometry, studied the efficacy of the preparation in vivo, interpreted the results, and drafted the manuscript. E.I. Ryabova optimised culture conditions for producer clone generation, analysed the quality of the preparation, and studied the efficacy of the preparation. I.B. Esmagambetov conceptualised and designed the study, interpreted the results, and edited the manuscript. D.V. Shcheblyakov designed the genetic construct expressing the Fc-fused single-domain antibody, and managed the experiments. A.N. Noskov conceptualised the study and produced and purified botulinum toxin A. I.D. Vinogradova conceptualised the study and studied the activity of the toxin. V.V. Prokofiev optimised chromatographic purification of the antibody and analysed the quality of the preparation. D.S. Polyansky generated the producer clone and optimised culture conditions for producer clone generation. D.Y. Logunov and A.L. Gintsburg managed the experiments and approved the final version of the manuscript for publication.

Ethics approval. The study was approved by the Bioethics Committee, National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation (Protocol No. 16 of 8 February 2019).

Acknowledgements. The authors express gratitude to their colleagues at the National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya for assistance with the study.