Разработка и валидация методики определения остаточного белка А в фармацевтических субстанциях терапевтических моноклональных антител

Введение

Благодаря способности связывать иммуноглобулины белок А золотистого стафилококка широко применяется в практической биотехнологии и биохимии. В частности, аффинные сорбенты с белком А в качестве лиганда часто используются для выделения терапевтических моноклональных антител в фармацевтическом производстве. Основные преимущества аффинной хроматографии на основе белка А при очистке терапевтических антител — способность специфически связывать антитела и возможность достигать высокой чистоты продукта. Однако недостатком данного метода является эффект вымывания белка А из носителя — часть белка А (лиганд) элюируется с колонки совместно с антителом [1].

Белок А является одним из факторов патогенности Staphylococcus aureus за счет способности связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов, однако кроме этого белок А может вызывать воспалительные реакции, инициируемые взаимодействием с TNF-α, фактором фон Виллебранда и рецептором к C1q-компоненту комплемента (C1qR) [2]. Известно, что производственные примеси, присутствующие после очистки продукта (белки клетки-хозяина, липиды или ДНК клеток-продуцентов, белки контаминирующих агентов и др.), могут индуцировать иммунный ответ или, выполняя роль адъювантов, стимулировать иммунные реакции на целевой рекомбинантный белок [3].

Используемый в настоящее время для аффинной хроматографии белок А был модифицирован путем сайт-направленного мутагенеза с целью повышения рН, при котором возможно элюирование антител с аффинного носителя [4]. Однако присутствие остаточного белка А в конечном продукте, тем не менее, возможно, что является нежелательным, в связи с чем должно контролироваться на всех этапах очистки.

Наиболее распространенными методами анализа остаточного белка А являются различные варианты иммуноферментного анализа (ИФА). Основной недостаток ИФА — невозможность обнаружения белка А в низких концентрациях (менее 1 нг/мл), что осложняется эффектом влияния присутствия неродственных соединений в образце (эффект матрицы), искажающим результаты.

На рынке представлены наборы реагентов ИФА различных производителей: Cygnus Technologies (США), GenScript (США), R&D Systems (США) и др. Однако не все наборы реагентов позволяют решить проблему, связанную с влиянием эффекта матрицы. Важным ограничивающим фактором являются трудности, связанные с логистикой иностранных наборов реагентов и их высокой стоимостью. Разработка набора реагентов для ИФА на основе реактивов собственного производства (in-house) может решить проблему импортозамещения и снизить затраты на контроль качества российских иммунобиологических препаратов.

Цель работы — разработка и валидация аналитической методики иммуноферментного определения остаточного белка А в фармацевтических субстанциях терапевтических моноклональных антител с использованием набора реагентов для ИФА на основе реактивов собственного производства (in-house).

Материалы и методы

Материалы

В работе использовали следующие реактивы:

• на стадиях хроматографической очистки, разработки и валидации методики, а также при иммунизации животных использовали рекомбинантный белок А (АО «ГЕНЕРИУМ»);
• полиэтиленгликоль 6000 (Sigma-Aldrich, кат. № 81260);
• для приготовления буферных растворов использовали натрия фосфат 1-замещенный 2-водный (PanReac AppliChem, кат. № 141677.0416), натрия хлорид (AKZO NOBEL Salt А/S, кат. № 11711/01-270421), натрия ацетат 3-водный (PanReac AppliChem, кат. № 131632.1211), натрия гидрофосфат (Sigma-Aldrich, кат. № S9736);
• ИФА проводили с использованием реагентов: натрия гидрокарбонат (Sigma-Aldrich, кат. № S6297), натрия карбонат безводный (Sigma-Aldrich, кат. № S7795), натрия гидроксид (PanReac AppliChem, кат. № 141687), бычий сывороточный альбумин (Sigma-Aldrich, кат. № A7030), фосфатно-солевой буфер рН 7,2–7,6 (ЭКО Сервис, кат. № В-60201), полисорбат 20 (PanReac AppliChem, кат. № 142312), желатин (Sigma-Aldrich, кат. № G1890-100G), трис(гидроксиметил)аминометан (Scharlau, кат. № TR04221000), тритон Х-100 (Sigma-Aldrich, кат. № T9284), лимонная кислота безводная (PanReac AppliChem, кат. № 141808.1211), 3-натрия цитрат 2-водный (PanReac AppliChem, кат. № 131655.1211), HEPES (BioFroxx, кат. № 1194KG001), 3,3’,5,5’ тетраметилбензидин (Биотест Системы, кат. № 01016-1), серная кислота концентрированная (PanReac AppliChem, кат. № 471058), соляная кислота (PanReac AppliChem, кат. № 141020.1611), набор для конъюгирования (Bio-Rad, кат. № LNK004P), рекомбинантный белок L (Thermo Scientific™, кат. № 21189), набор реагентовMix-N-Go Protein A Assay (Cygnus Technologies, США, кат. № F610).

Методы

Иммунизация. Экспериментальные работы проводили на базе ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии» (ФГБНУ ФИЦВиМ) на курах-несушках породы Русская (виварий лаборатории молекулярной вирусологии). Протокол исследования на животных был одобрен этическим комитетом ФГБНУ ФИЦВиМ (протокол № 05-23 от 18.07.2023). Выбор экспериментальных животных обусловлен следующими факторами: птичьи иммуноглобулины IgY (функциональный эквивалент IgG млекопитающих) не имеют сайтов связывания белка А; IgY накапливаются в желтках, что позволяет проводить гуманную иммунизацию без тотального отбора крови у животных [5][6].

Проводили пятикратную иммунизацию с двухнедельным интервалом. В качестве антигена использовали белок А (АО «ГЕНЕРИУМ») в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (для первого введения) или неполным адъювантом Фрейнда (для следующих введений). Отбор яиц осуществляли с 49 сут и до окончания иммунизации.

Выделение и очистка антител. Куриные антитела выделяли путем осаждения полиэтиленгликолем 6000 по стандартной методике [7]. Осадок антител растворяли буфером, содержащим 15 мМ натрия фосфат, 150 мМ натрия хлорид, pH 7,4 из расчета 5 мл буфера на 1 желток.

Очистку антител проводили с использованием метода аффинной хроматографии с помощью хроматографа AKTA avant 25 (GE HealthCare, Швеция) с применением сорбента с иммобилизованным белком А в качестве лиганда. Хроматографическую колонку Tricorn 10/150 (GE HealthCare, Швеция) объемом 10 мл перед нанесением образца промывали 5 объемами буфера для нанесения (15 мМ натрия фосфат, 150 мМ натрия хлорид, pH 7,4) при скорости потока 380 см/ч. Антитела перед началом хроматографии разбавляли буфером для нанесения в три раза и наносили на колонку со скоростью потока 300 см/ч, после чего колонку промывали 5 объемами буфера для нанесения и кондиционирующего буфера (10 мМ натрия фосфат, 10 мM натрия ацетат, 50 мM натрия хлорид, pH 6,5) со скоростью 380 см/ч. Элюцию проводили в присутствии кислого буфера (50 мM натрия ацетат, 50 мМ натрия хлорид, pH 2,8) при скорости потока 300 см/ч. Момент начала сбора фракции соответствовал значению оптической плотности элюата 20 mAU при длине волны 280 нм; сбор фракции заканчивали (после прохождения максимума на кривой элюции) при снижении значения оптической плотности до 30 mAU. По окончании элюции в целевую фракцию добавляли 0,5 M натрия гидрофосфат до конечной концентрации 50 мМ и 1 М натрия гидроксид до значения pH 7,0.

Иммуноферментный анализ. Методика определения остаточного белка А в присутствии моноклональных антител основана на сэндвич-ИФА с использованием образцов, прошедших предварительную подготовку. В лунки планшета для ИФА вносили куриные антитела к белку А (0,5 мкг/лунка), сорбцию проводили в течение 14–16 ч при 5 °C. На этапе пробоподготовки к образцам и калибровочным растворам добавляли денатурирующий буфер, инкубировали 15 мин при комнатной температуре. После инкубации и центрифугирования образцов 25 мкл супернатанта вносили в лунки планшета с нейтрализующим буфером, инкубировали 1,5 ч при 25 °C. Образовавшийся комплекс «белок А — моноклональное антитело» выявляли с помощью куриных антител к белку А (0,07 мкг/лунку), конъюгированных с пероксидазой хрена; инкубацию проводили в течение 1 ч при 25 °C. Оптическую плотность окрашенного продукта определяли с использованием спектрофотометра xMark (Bio-Rad, США) при длинах волн 450/650 нм.

Результаты измерений обрабатывали автоматически с помощью программного обеспечения Microplate Manager (Bio-Rad, США) путем построения калибровочного графика зависимости среднего значения оптической плотности каждого из калибровочных растворов от десятичного логарифма содержания белка А, применяя 4-параметрическую логистическую функцию.

Приготовление модельных и калибровочных растворов. Калибровочные растворы готовили путем внесения рекомбинантного белка А в буферный раствор для разведения образцов до концентраций 10,00, 5,00, 2,50, 1,25, 0,63, 0,31 и 0,16 нг/мл.

Для разработки методики готовили модельные образцы из 6 различных субстанций моноклональных антител производства АО «ГЕНЕРИУМ» (A, B, C, D, E, F) с добавлением 100 нг/мл белка А в каждую. Все модельные образцы и субстанции (без внесения белка А) исследовали в разведениях 1:40, 1:80, 1:160, 1:320.

Для проведения валидации методики (оценка правильности и прецизионности) готовили модельные образцы субстанции E. В субстанцию вносили рекомбинантный белок А до концентрации 10, 16, 20, 24, 40 нг/мл. Для оценки специфичности в буфер готовой лекарственной формы моноклонального антитела на основе субстанции E добавляли 10 нг/мл, в субстанцию E — 50 нг/мл рекомбинантного белка L (иммуноглобулин-связывающий белок, используемый для выделения моноклональных антител наряду с белком А).

Перед проведением валидационных испытаний полученные модельные образцы разводили в 10, 20, 40 и 80 раз буфером для разведения.

Статистическая обработка результатов. Для оценки результатов валидации использовали статистические методы анализа с вычислением коэффициента вариации (coefficient of variation, CV, %) и степени извлечения (recovery, R, %). Коэффициент вариации рассчитывали как отношение стандартного отклонения (relative standard deviation, RSD) к среднему значению экспериментально установленной концентрации белка А (найденное значение), выраженное в процентах. Степень извлечения рассчитывали как отношение найденного значения к истинному значению концентрации белка А, внесенному в модельный образец (номинальное значение), выраженное в процентах¹. Все расчеты проводили в программе Microsoft Office Excel 2016.

Результаты и обсуждение

Разработка методики определения остаточного белка А

На первом этапе разработки методики необходимым условием был подбор оптимальных составов буферных растворов для проведения ИФА. Для получения корректных результатов перед проведением анализа необходимо обеспечить разрыв связи в комплексе «белок А — моноклональное антитело» и не допустить повторного образования комплекса (рис. 1) [8]. Подбор условий диссоциации осложняется природой образования комплекса, так как белок А может реагировать с Fc-фрагментом большинства IgG, Fab-фрагментом антител, содержащих V_HIII домен, и паратопом специфичных антител [9].

В ходе исследования взаимодействия белка А и IgG1 было показано, что при рН 3,0 разрушаются электростатические взаимодействия молекулы белка А и иммуноглобулина и молекулы диссоциируют [10]. Таким образом, на этапе пробоподготовки рН испытуемых образцов необходимо поддерживать на уровне не выше 3,0. Однако куриные иммуноглобулины IgY активны в диапазоне pH от 3,5 до 11,0 [6], следовательно, перед нанесением на планшет для ИФА подкисленные образцы должны пройти нейтрализацию. Нейтрализация образцов, в свою очередь, может привести к повторному образованию комплекса «белок А — моноклональное антитело» и снижению чувствительности из-за эффекта матрицы [11]. Для решения этой проблемы необходимо было денатурировать моноклональные антитела таким образом, чтобы они не могли повторно взаимодействовать с белком А (рис. 2).

Были подобраны оптимальные составы буферного раствора для разведения образцов, денатурирующего и нейтрализующего буферных растворов, которые образуют единую систему, позволяющую с достаточной правильностью определять аналит (табл. 1). Значения pH всех буферных растворов подобраны таким образом, что при добавлении в буфер для разведения денатурирующего буфера обеспечивается значение рН, равное 3,0, а при внесении подготовленных образцов в нейтрализующий буфер значение pH не сдвигается в сторону кислых значений.

С применением описанных буферных растворов был проведен ИФА. В качестве образцов были использованы субстанции шести различных моноклональных антител, относящихся к подклассам IgG1 (субстанции A, C, D и E), IgG2 (субстанция B), IgG4 (субстанция F), а также модельные образцы с внесением 100 нг/мл белка А в каждый образец субстанции. Результаты проведенных экспериментов показали эффективность денатурации и правильность методики: степень извлечения для модельных образцов не выходила за пределы 20% отклонения от номинального значения (рис. 3). При этом эффективность ИФА не зависела от подкласса IgG. Содержание белка А в субстанциях без внесения белка А было ниже предела чувствительности методики, поэтому было приравнено к нулю (данные не представлены).

Валидация методики определения остаточного белка А

Валидацию методики проводили с использованием субстанции Е в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации XV изд. (ГФ РФ XV)² и Решения Коллегии Евразийской экономической комиссии № 113³. Согласно указанным документам аналитическая методика количественного определения примесей должна быть оценена по следующим валидационным характеристикам: правильность (accuracy), повторяемость (repeatability), промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность (intermediate (intra-laboratory) precision), селективность (selectivity), специфичность (specificity), нижний предел количественного определения (lower limit of quantification), линейность (linearity), диапазон применения (аналитическая область) (range). Кроме перечисленных критериев также были оценены минимально необходимое разведение (minimum required dilution) и межлабораторная прецизионность (inter-laboratory precision).

Оценка правильности между аналитическими циклами и внутрилабораторной прецизионности. Правильность между аналитическими циклами и внутрилабораторная прецизионность оценивались совместно в шести независимых опытах (табл. 2). Пять модельных образцов, содержащих от 10 до 40 нг/мл белка А, и субстанцию без внесения белка А испытывали в четырех разведениях в двух повторностях каждое (раздел «Материалы и методы», подраздел «Приготовление модельных и калибровочных растворов»). В испытаниях участвовали два аналитика, каждый из которых не проводил более одного опыта для оценки правильности в один день. После расчета среднего значения (по шести опытам) для каждого образца определяли степень извлечения (R, %) и коэффициент вариации и оценивали их приемлемость по критериям:

• для образцов с концентрацией белка А 10 нг/мл значение Rдолжно быть в пределах 75–125%, для остальных образцов — 80–120%;
• для образцов с концентрацией белка А 10 нг/мл значение CVне должно превышать 25%, для остальных образцов — 20%.

Значения R и CV в каждом опыте удовлетворяли установленным критериям, что подтвердило правильность и прецизионность методики между аналитическими циклами.

Оценка правильности и прецизионности внутри аналитического цикла. Правильность внутри аналитического цикла и прецизионность (повторяемость) оценивались совместно в пяти независимых опытах (табл. 3). В каждом опыте анализировали шесть независимых повторностей одного из шести модельных образцов в четырех разведениях в двух повторностях каждое (раздел «Материалы и методы», подраздел «Приготовление модельных и калибровочных растворов»). После расчета среднего значения (по шести повторностям) каждого образца определяли R и CV и оценивали их приемлемость по критериям аналогично оценке правильности между циклами и повторяемости.

Полученные значения R и CV для каждого модельного образца удовлетворяли установленным критериям приемлемости. Таким образом, правильность и прецизионность методики внутри аналитического цикла были подтверждены.

Оценка специфичности и селективности. Методика должна однозначно оценивать содержание определяемого вещества в присутствии сопутствующих компонентов. Поэтому селективность и специфичность методики определения остаточного белка А оценивались путем измерения содержания белка А в трех модельных образцах:

1. буфер готовой лекарственной формы моноклонального антитела на основе субстанции E;
2. буфер готовой лекарственной формы, содержащий 10 нг/мл белка А;
3. субстанция E, содержащая 50 нг/мл белка L.

Оптическая плотность в разведениях модельного образца 1 не превышала оптическую плотность буферного раствора для разведения образцов без белка А, поэтому содержание анализируемого вещества приравнивалось к 0 (табл. 4). В модельном образце 2 содержание белка А определялось с необходимой правильностью: R в пределах 80–120%. Полученные результаты подтверждают отсутствие перекрестной реакции с компонентами раствора.

Отсутствие реакции с белком L в разведениях модельного образца 3 указывает на специфичность используемых в анализе антител к белку А и отсутствие перекрестной реакции с другим белком, способным связывать иммуноглобулины.

Оценка нижнего предела количественного определения и минимально необходимого разведения. Нижний предел количественного определения (НПКО) субстанции напрямую зависит от минимально необходимого разведения. Валидируемая методика имеет ограничения, связанные с содержанием моноклональных антител в растворе. Если концентрация антител в образце превышает 2 мг/мл, то наблюдается эффект матрицы, что приводит к ложноотрицательным результатам анализа. Таким образом, субстанция Е, содержащая 20 мг/мл белка, должна быть разведена не менее чем в 10 раз. Каждый проведенный эксперимент подтвердил, что образцы субстанции Е, содержащие белок А в диапазоне 10–40 нг/мл, в разведении 1:10 определялись с требуемой правильностью.

В качестве НПКО выбрано значение 10 нг/мл белка А, так как оптическая плотность двух последовательных разведений такого образца (1:10 и 1:20) превосходила оптическую плотность наименьшего калибровочного раствора, а содержание белка А определялось с требуемой правильностью.

Оценка линейности и аналитической области. Линейность и аналитическая область оценивались совместно с правильностью между аналитическими циклами. Регрессионная зависимость среднего значения найденной в модельных образцах концентрации белка А от фактически внесенной концентрации имеет линейный характер (рис. 4).

Коэффициент корреляции (R²) полученной линейной функции составил 0,9985, k=0,9242, что соответствует заданным критериям приемлемости (R²≥0,99; 0,8≤k≤1,2). Аналитическая область была определена как интервал концентрации остаточного белка А от 10 до 40 нг/мл, что представляет собой диапазон 50–200% от допустимого содержания белка А в субстанции Е (20 нг/мл).

Оценка межлабораторной прецизионности. Межлабораторную прецизионность оценивали как отношение среднего значения найденной в модельных образцах концентрации белка А аналитиками второй лаборатории к среднему значению найденной в модельных образцах концентрации белка А аналитиками первой лаборатории (R, %). Полученные результаты (табл. 5) оценивались согласно критерию приемлемости: отношение должно находиться в интервале от 80 до 120% (для модельного образца 10 нг/мл — от 75 до 125 %).

Результаты оценки межлабораторной прецизионности удовлетворяли заданным критериям. Таким образом, воспроизводимость методики была подтверждена.

Сравнение разработанной методики c использованием набора реагентов для ИФА на основе реактивов собственного производства (in-house) с коммерческим набором реагентов

Так как разработанная методика соответствовала всем валидационным критериям, на следующем этапе работы была рассмотрена ее пригодность в качестве альтернативы коммерческому набору реагентов Mix-N-Go Protein A Assay.

Проводили параллельное измерение содержания белка А в двух субстанциях (D и E) и их полупродуктах (промежуточные продукты процесса хроматографической очистки), полученных на производстве, с использованием набора реагентов для ИФА на основе реактивов собственного производства (in-house) и коммерческого набора реагентов Mix-N-Go Protein A Assay (табл. 6). Определение содержания белка А в полупродуктах необходимо в рамках характеризации и валидации процесса очистки. Результаты, полученные с помощью набора реагентов для ИФА на основе реактивов собственного производства, находились в пределах 80–120% от значений, полученных с применением коммерческого набора, что указывает на сопоставимость полученных данных и возможность применения разработанной методики для определения содержания белка А не только в субстанции, но и в ее полупродуктах.

Выводы

1. Разработана методика определения остаточного белка А в фармацевтических субстанциях терапевтических моноклональных антител с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа на основе реактивов собственного производства (in-house). Подобран состав буферных растворов для проведения анализа (буфер для разведения образцов, денатурирующий и нейтрализующий буферы), что позволило решить проблему эффекта матрицы.
2. Проведена валидация методики определения остаточного белка А. Установлено, что методика соответствует всем валидационным параметрам: полученные значения при оценке правильности методики находились в пределах 83–108% от номинального, при оценке межлабораторной прецизионности — в пределах 96–116%, при оценке повторяемости — до 13%. Нижний предел количественного определения составил 10 нг/мл, минимально необходимое разведение — 1:10, аналитическая область — 10–40 нг/мл.
3. Результаты, полученные с помощью набора реагентов для иммуноферментного анализа с реактивами собственного производства (in-house), сопоставимы с данными, получаемыми при использовании коммерческого набора реагентов иностранного производства. Применение разработанной методики определения остаточного белка А и набора реагентов с реактивами собственного производства позволит решить проблему импортозамещения и снизить затраты на контроль качества российских иммунобиологических препаратов.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.В. Ноздрина — выполнение экспериментальных работ (разработка методики, приготовление модельных образцов, проведение валидационных испытаний, интерпретация результатов исследования, оценка всех валидационных характеристик методики), написание текста рукописи; Д.А. Мазалев — выделение и хроматографическая очистка антител, редактирование текста рукописи; Д.Р. Рогозина — выполнение экспериментальных работ (приготовление модельных образцов, проведение валидационных испытаний); С.П. Живодеров — проведение иммунизации животных; И.В. Лягоскин — разработка концепции исследования, критический пересмотр содержания рукописи; Р.Р. Шукуров — утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. E.V. Nozdrina conducted experiments (developed the analytical procedure, prepared simulated samples, validated the procedure, interpreted the study results (assessed all validation characteristics of the procedure), and drafted the manuscript. D.A. Mazalev performed isolation and chromatographic purification of antibodies and edited the manuscript. D.R. Rogozina conducted experiments (prepared simulated samples and validated the procedure). S.P. Zhivoderov immunised animals. I.V. Lyagoskin conceptualised the study, critically reviewed the manuscript. R.R. Shukurov approved the final version of the manuscript for publication.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования с использованием экспериментальных животных был одобрен этическим комитетом ФГБНУ ФИЦВиМ (протокол № 05-23 от 18.07.2023).

Благодарности. Авторы выражают благодарность начальнику лаборатории хроматографических методов И.П. Фабричному за активное участие разработке методики.

Ethics approval. The animal study protocol was approved by the ethics committee at the Federal Research Center for Virology and Microbiology (Protocol No. 05-23 dated 18 July 2023).

Acknowledgements. The authors are grateful to I.P. Fabrichny, Head of the laboratory of chromatographic methods, for active participation in the development of the analytical procedure.