Лиофилизация бактериальных тест-штаммов в аппарате коллекторного типа: влияние параметров замораживания и высушивания, объема заполнения ампул и плотности ватного фильтра

Актуальность. В работе Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России основной метод работы — лиофилизация, обеспечивающая сохранение свойств депонированных тест-штаммов. Для успешной лиофилизации необходимо экспериментальное определение основных параметров и критических условий процесса.

Цель. Оценить влияние скорости и времени замораживания, времени высушивания, объема заполнения ампул, плотности ватного фильтра на качество коллекционных бактериальных тест-штаммов при лиофилизации на аппарате коллекторного типа.

Материалы и методы. Тест-штаммы Pseudomonas aeruginosa NCTC 12924, Staphylococcus aureus NCTC 10788, Salmonella Abony NCTC 6017 высушивали методом лиофилизации на аппарате коллекторного типа. Замораживание велось при температуре –70±2 °С в низкотемпературном морозильнике (медленная заморозка) и в смеси «сухого льда» со спиртом (быстрая заморозка). Статистическую обработку данных проводили при помощи программ MS Exсel и Statistica, v. 10.

Результаты. Время замораживания ампул в низкотемпературном морозильнике при –70±2 °С не менее 4 ч, дальнейшее хранение возможно при данной температуре до 1 мес. без потери качества конечного продукта. Время замораживания ампул в смеси «сухого льда» и спирта составило менее 1 мин. Различий в показателях качества лиофилизатов, полученных при быстрой и медленной заморозке, не выявлено, кроме внешнего вида: при быстром замораживании таблетка лиофилизата формируется неровная, легко отделяется от стекла и крошится, что нежелательно. Длительность этапа первичного высушивания ампул наполнения 0,2 мл составила 6–8 ч. Показано, что время досушивания в течение 11, 18, 35 и 59 ч приводит к получению лиофилизатов сравнимого качества: количество жизнеспособных микробных клеток (КОЕ/мл) сразу после лиофилизации и по завершении стресс-теста во всех случаях статистически значимо не отличалось. Содержание остаточной влаги при досушивании в течение 59 ч — менее 2 %. Плотность ватного фильтра имеет критическое влияние на качество лиофилизата, рекомендуется использование ватного фильтра массой не более 50 мг.

Выводы. Изучены основные этапы высушивания коллекционных тест-штаммов на аппарате коллекторного типа. Исследовано влияние на качество конечного продукта следующих факторов: скорости и времени замораживания, длительности высушивания, объема заполнения ампул, плотности ватного фильтра. Полученные результаты используются в работе коллекции микроорганизмов.

1. Червякова НС, Валова ТВ, Осин АВ. Использование лиофильных аппаратов камерного типа в коллекциях патогенных микроорганизмов. Проблемы особо опасных инфекций. 2014;(3):65–8. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2014-3-65-68

2. Чемисова ОС, Сагакянц ММ, Голенищева ЕН, Полеева МВ, Морозова ИВ. Лиофилизация коллекционных штаммов холерных вибрионов на аппарате коллекторного типа с использованием адсорбентов. Бактериология. 2018;3(4):16–20. https://doi.org/10.20953/2500-1027-2018-4-16-20

3. Блынская ЕВ, Тишков CВ, Алексеев КВ, Минаев CВ. Математическое моделирование этапа замораживания в технологии лиофилизированных лекарственных форм. Российский биотерапевтический журнал. 2018;17(2):15–21. https://doi.org/10.17650/1726-9784-2018-17-2-15-21

4. Kasper JC, Friess W. The freezing step in lyophilization: physico-chemical fundamentals, freezing methods and consequences on process performance and quality attributes of biopharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2011;72(2):248–63. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2011.03.010

5. Assegehegn G, Brito-de la Fuente E, Franco JM, Gallegos C. The importance of understanding the freezing step and its impact on freeze-drying process performance. J Pharm Sci. 2019;108(4):1378–95. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2018.11.039

6. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol. 1984;247(3 Pt 1):C125–42. https://doi.org/10.1152/ajpcell.1984.247.3.C125

7. Zhao G, Zhang G. Effect of protective agents, freezing temperature, rehydration media on viability of malolactic bacteria subjected to freeze-drying. J Appl Microbiol. 2005;99(2):333–8. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2005.02587.x

8. Wang GQ, Pu J, Yu XQ, Xia YJ, Ai LZ. Influence of freezing temperature before freeze-drying on the viability of various Lactobacillus plantarum strains. J Dairy Sci. 2020;103(4):3066–75. https://doi.org/10.3168/jds.2019-17685

9. Jena S, Krishna Kumar NS, Aksan A, Suryanarayanan R. Stability of lyophilized albumin formulations: role of excipient crystallinity and molecular mobility. Int J Pharm. 2019;569:118568. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2019.118568

10. Piszkiewicz S, Pielak GJ. Protecting enzymes from stress-induced inactivation. Biochemistry. 2019;58(37):3825–33. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.9b00675

11. Rockinger U, Funk M, Winter G. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. J Pharm Sci. 2021;110(8):2873–93. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2021.04.018

12. Horn J, Friess W. Detection of collapse and crystallization of saccharide, protein, and mannitol formulations by optical fibers in lyophilization. Front Chem. 2018;6:4. https://doi:10.3389/fchem.2018.00004

13. Gaidhani KA, Harwalkar M, Bhambere D, Nirgude PS. Lyophilization/freeze drying — a review. WJPR. 2015;4(8):516–43.

14. Chang LL, Shepherd D, Sun J, Tang XС, Pikal MJ. Effect of sorbitol and residual moisture on the stability of lyophilized antibodies: Implications for the mechanism of protein stabilization in the solid state. J Pharm Sci. 2005;94(7):1445–55. https://doi.org/10.1002/jps.20363

15. Peiren J, Hellemans A, de Vos P. Impact of the freeze-drying process on product appearance, residual moisture content, viability, and batch uniformity of freeze-dried bacterial cultures safeguarded at culture collections. Appl Microbiol Biotechnol. 2016;100(14):6239–49. https://doi.org/10.1007/s00253-016-7359-1

16. Morgan CA, Herman N, White PA, Vesey G. Preservation of micro-organisms by drying; a review. J Microbiol Methods. 2006;66(2):183–93. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2006.02.017

17. Rey L, May JC, eds. Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products. 3rd ed. CRC Press; 2010. https://doi.org/10.3109/9781439825761

18. Сакаева ИВ, Бунятян НД, Ковалева ЕЛ, Саканян ЕИ, Митькина ЛИ, Прокопов ИА и др. Основные подходы к изучению стабильности лекарственных средств: отечественный и международный опыт. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2013;(3):8–11. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2013-0-3

19. Miyamoto-Shinohara Y, Sukenobe J, Imaizumi T, Nakahara T. Survival of freeze-dried bacteria. J Gen Appl Microbiol. 2008;54(1):9–24. https://doi.org/10.2323/jgam.54.9

20. Patel SM, Nail SL, Pikal MJ, Geidobler R, Winter G, Hawe A, et al. Lyophilized drug product cake appearance: what is acceptable? J Pharm Sci. 2017;106(7):1706–21. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2017.03.014