Перспективы применения метода проточной цитометрии в оценке качества препарата вакцины чумной живой

Актуальность. Показатель качества «Количество живых микробных клеток» определяется на всех этапах производства вакцины чумной живой. В настоящее время для определения количества живых микробных клеток используют бактериологический метод. Однако для повышения точности анализа и сокращения времени его проведения перспективным представляется использование метода проточной цитометрии.

Цель. Изучить возможность применения метода проточной цитометрии в оценке качества препарата вакцины чумной живой.

Материалы и методы. Использовали экспериментальные серии вакцины чумной живой (пять серий). Изучение показателя качества «Количество живых микробных клеток» в препарате вакцины проводили бактериологическим методом согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (ФС.3.3.1.0022.15). Цитофлуориметрический анализ образцов проводили с использованием флуоресцентного красителя SynaptoGreen.

Результаты. Проведена оценка значения количества живых микробных клеток в образцах вакцин бактериологическим методом, что составило от 27,8±2,2 до 56,5±3,1% (в среднем — 39,8±5,4%), и методом проточной цитометрии — от 29,2±1,2 до 59,1±2,1%, (в среднем — 41,7±5,5%). Статистическая обработка данных показала, что результаты контроля качества препарата вакцины, полученные обоими методами, не имели достоверных различий и характеризовались высоким коэффициентом детерминации.

Выводы. Показана целесообразность применения метода проточной цитометрии при контроле качества препарата чумной вакцины при определении количества живых микробных клеток. Высокая информативность, быстрота и простота выполнения анализа делают метод проточной цитометрии более предпочтительным в сравнении с традиционными методами анализа.

1. Касина ИВ, Ращепкин ЛИ, Горяев АА, Алексеева СА, Немировская ТИ, Мовсесянц АА. Оценка качества вакцины туляремийной живой по результатам испытаний в рамках обязательной сертификации. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016;16(4):253–9. EDN: UWBNNH

2. Fukui M, Takii S. Reduction of tetrazolium salts by sulfate-reducing bacteria. FEMS Microbiol Ecol. 1989;62(1):13–20. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1989.tb03653.x

3. Bhupathiraju VK, Hernandez M, Landfear D, Alvarez-Cohen L. Application of a tetrazolium dye as an indicator of viability in anaerobic bacteria. J Microbiol Methods. 1999;37(3):231–43. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(99)00069-x

4. Johnson MB, Criss AK. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. 2013;(79):e50729. https://doi.org/10.3791/50729

5. Фихман БА. Иммерсионная микрорефрактометрия бактериальных клеток. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1963;(5).

6. Ломакина ГЮ, Модестова ЮА, Угарова НН. Биолюминесцентная детекция жизнеспособности клеток (обзор). Биохимия. 2015;80(6):829–44. EDN: UAAWWF

7. Угарова НН, Ломакина ГЮ, Перевышина ТА, Отрашевская ЕВ, Черников СВ. Контроль жизнеспособности клеток БЦЖ-вакцины в процессе ее производства методом биолюминесцентной АТФ-метрии. Вестник Московского университета. Серия 2: Химия. 2019;60(4):254–62. EDN: TVEZMT

8. Ou F, McGoverin C, Swift S, Vanholsbeeck F. Rapid and cost-effective evaluation of bacterial viability using fluorescence spectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2019;411(16):3653–63. https://doi.org/10.1007/s00216-019-01848-5

9. Shimomura Y, Ohno R, Kawai F, Kimbara K. Method for assessment of viability and morphological changes of bacteria in the early stage of colony formation on a simulated natural environment. Appl Environ Microbiol. 2006;72(7):5037–42. https://doi.org/10.1128/AEM.00106-06

10. Pianetti A, Falcioni T, Bruscolini F, Sabatini L, Sisti E, Papa S. Determination of the viability of Aeromonas hydrophila in different types of water by flow cytometry, and comparison with classical methods. Appl Environ Microbiol. 2005;71(12):7948–54. https://doi.org/10.1128/AEM.71.12.7948-7954.2005

11. Gweon E, Choi C, Kim J, Kim B, Kang H, Park T, et al. Development of a new approach to determine the potency of bacille Calmette–Guérin vaccines using flow cytometry. Osong Public Health Res Perspect. 2017;8(6):389–96. https://doi.org/10.24171/j.phrp.2017.8.6.06

12. Лопатина НВ, Мишанькин БН. Экспериментальная адаптация вакцинного штамма чумного микроба к процессу лиофилизации. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018;17(3):51–6. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-3-51-56

13. Massicotte R, Mafu AA, Ahmad D, Deshaies F, Pichette G, Belhumeur P. Comparison between flow cytometry and traditional culture methods for efficacy assessment of six disinfectant agents against nosocomial bacterial species. Front Microbiol. 2017;8:112. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00112

14. Фисун АА, Абзаева НВ, Ковалев ДА, Кузнецова ИВ, Жиров АМ, Гостищева СЕ и др. Определение количества живых микробных клеток в препарате вакцины чумной живой методом проточной цитометрии. В кн.: Материалы региональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы особо опасных инфекций на Северном Кавказе». Ставрополь; 2022. С. 217–8. EDN: YMVOQI

15. Shi L, Gunther S, Hubschmann T, Wick LY, Harms H, Muller S. Limits of propidium iodide as a cell viability indicator for environmental bacteria. Cytometry A. 2007;71(8):592–8. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20402

16. Vanhauteghem D, Demeyere K, Callaert N, Boelaert A, Haesaert G, Audenaert K, et al. Flow cytometry is a powerful tool for assessment of the viability of fungal conidia in metalworking fluids. Appl Environ Microbiol. 2017;83(16):e00938-17. https://doi.org/10.1128/AEM.00938-17

17. Zahavy E, Rotem S, Gur D, Aloni-Grinstein R, Aftalion M, Ber R. Rapid antibiotic susceptibility determination for Yersinia pestis using flow cytometry Spectral Intensity Ratio (SIR) fluorescence analysis. J Fluoresc. 2018;28(5):1151–61. https://doi.org/10.1007/s10895-018-2279-3

18. Cossarizza A, Chang H-D, Radbruch A, Acs A, Adam D, Adam-Klages S, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019;49(10):1457–973. https://doi.org/10.1002/eji.201970107