Чувствительность клеточных линий к вирусу Чикунгунья и подбор метода наработки вирусного материала в промышленных объемах

Рост случаев заболевания лихорадкой Чикунгунья регистрируется в странах Карибского бассейна, Центральной и Южной Америки и Юго-Восточной Азии. Специфического лечения против этого заболевания нет, лечение проводится симптоматическое, что делает разработку вакцин против лихорадки Чикунгунья весьма актуальной. Для разработки инактивированной цельновирионной вакцины против лихорадки Чикунгунья важен выбор чувствительной культуры клеток, которая обеспечивает высокую продукцию вируса, а также используется в производстве вакцинных препаратов.

Цель работы: изучение чувствительности различных линий клеток к заражению вирусом Чикунгунья и подбор метода культивирования клеток для максимального накопления и сбора вируса с монослоя.

Материалы и методы: в работе использовали вирус Чикунгунья штамм CHIKV_Nic, линии клеток ФЭК, MRC-5, Vero и 4647; титрование проводили на клетках линии С6/36. При подборе метода культивирования использовали культуральный флакон, клеточную фабрику, роллерную бутыль. Чувствительность клеточных линий к репродукции вируса выявляли по степени накопления инфекционного агента в культуральной жидкости (КЖ). Результат титрования учитывали на 5 сут по выраженному цитопатическому действию вируса.

Результаты: наибольшую чувствительность к заражению и максимальное накопление вируса в КЖ продемонстрировали клеточные линии 4647 и Vero. Клетки линий ФЭК и MRC-5 накапливали вирус в меньших концентрациях. Максимальные титры накопления вируса в КЖ клеточной линии Vero (7,10–7,75 lg ТЦД₅₀/мл) отмечались через 48 ч с момента заражения; оптимальной является множественность заражения (MOI) в диапазоне 0,001– 0,0001 MOI/кл. При множественности заражения 0,0001 MOI/кл накопление вируса в клетках линии Vero при роллерном культивировании происходит на 2 сут с максимальным титром вируса 8,6±0,2 lg ТЦД₅₀/мл.

Выводы: линия клеток Vero соответствует требованиям стабильности и безопасности при производстве вакцины против лихорадки Чикунгунья. Определена минимальная множественность заражения культуры клеток вирусом Чикунгунья. Применение роллерного метода позволяет получить наиболее высокий выход клеточной культуры и, соответственно, наиболее высокое значение титра вируса в КЖ.

1. Weaver SC, Lecuit M. Chikungunya virus and the global spread of a mosquito-borne disease. N Engl J Med. 2015;372:1231–9. https://doi.org/10.1056/NEJMra1406035

2. Deeba F, Islam A, Kazim SN, Naqvi IH, Broor Sh, Ahmed A, Parveen S. Chikungunya virus: recent advances in epidemiology, host pathogen interaction and vaccine strategies. Pathog Dis. 2016;74(3)3:ftv119. https://doi.org/10.1093/femspd/ftv119

3. Staples JE, Breiman RF, Powers AM. Chikungunya fever: an epidemiological review of a re-emerging infectious disease. Clin Infect Dis. 2009;49(6):942–8. https://doi.org/10.1086/605496

4. Caglioti C, Lalle T, Castilletti C, Carletti F, Capobianchi MR, Bordi L. Chikungunya virus infection: an overview. New Microbiol. 2013;36(3):211–27.

5. Galatas B, Ly S, Duong V, Baisley K, Nguon K, Chan S, et al. Long-lasting immune protection and other epidemiological findings after Chikungunya emergence in a Cambodian Rural Community, April 2012. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10(1):e0004281. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004281

6. Erasmus JH, Rossi SL, Weaver SC. Development of vaccines for Chikungunya fever. J Inf Dis. 2016;214(S5):S488–96. https://doi.org/10.1093/infdis/jiw271

7. Tiwari M, Parida M, Santhosh SR, Khan M, Dash PK, Rao PV. Assessment of immunogenic potential of Vero adapted formalin inactivated vaccine derived from novel ECSA genotype of Chikungunya virus. Vaccine. 2009;27(18):2513–22. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.02.062

8. Игнатьев ГМ, Каа КВ, Оксанич АС, Антонова ЛП, Самарцева ТГ, Мефед КМ и др. Индикация и идентификация вирусов денге и Чикунгунья в комарах рода Aedes spp., отловленных в Центральной Америке. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020;97(3):227–32. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-4

9. Louis KS, Siegel AC. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. In: Stoddart M, ed. Mammalian Cell Viability. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Vol. 740. Humana Press; 2011. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-108-6_2

10. Грачев ВП, Хапчаев ЮХ. Применение перевиваемых линий клеток человека и животных для изготовления вирусных вакцин. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008;(1):82–90.

11. Миронова ЛЛ, Грачев ВП, Кузнецова НВ, Попова ВД. Способ культивирования вирусов. Авторское свидетельство СССР № 770195; 1981.

12. Ашмарин ИП, Воробьев АА. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, Ленинградское отделение; 1962.

13. Стрельцова МА, Агафонов АП, Игнатьев ГМ. Чувствительность культур клеток различных линий к вирусу Марбург. Вопросы вирусологии. 1991;36(5):437–8.

14. Хапчаев ЮХ, Хоретоненко МВ, Тимофеев АВ, Грачев ВП. Репродукция штамма Софьин вируса клещевого энцефалита в клетках линии Vero, культивируемых на микроносителях в условиях псевдосуспензии. Биотехнология. 2003;5:32–9.

15. Куслий АГ, Волчков ВЕ, Рыжиков АБ, Михайлова ТВ, Сергеев АН. Инактивированная вакцина против венесуэльского энцефаломиелита лошадей и способ ее получения. Патент Российской Федерации № 2035191; 1995.

16. Spier RE, Maroudas N. Microcarriers for animal cell biotechnology: an unfulfilled potential. Biotechnology. 1991;17:191–212. https://doi.org/10.1016/b978-0-409-90123-8.50014-8