Исследование гемостимулирующих свойств рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека

Гемостимулирующие свойства гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) позволяют использовать его в клинике для снижения побочных эффектов радио- и химиотерапии онкологических заболеваний, при трансплантации костного мозга, для лечения некоторых первичных иммунодефицитных состояний, связанных с лейкопенией. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора разработана высокопроизводительная технология получения рекомбинантного ГМ-КСФ человека (рчГМ-КСФ) на основе рекомбинантного штамма E. coli. Цель работы: изучение гемостимулирующей активности препарата рекомбинантного ГМ-КСФ человека, полученного по разработанной технологии, в культуре клеток и на модели миелосупрессии у мышей, вызванной введением циклофосфана. Материалы и методы: оценку гемостимулирующей активности рчГМ-КСФ in vitro проводили с использованием МТТ-теста на коммерческой культуре клеток промиелоцитарной лейкемии HL-60, скорость роста которых предварительно подавляли добавлением в среду низкой концентрации диметилсульфоксида. Исследования in vivo проводили на мышах линии СВА/Calaс в условиях миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана. Гемостимулирующие свойства препарата оценивали при его подкожном введении в диапазоне доз от 1 до 175 мкг/кг в течение 4–5 суток после введения цитостатика. В образцах крови, взятых в разные сроки после введения, определяли общее количество лейкоцитов и содержание их морфологических форм. Данные эксперимента обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета программ Statgraphics, v. 5.0. Результаты: пролиферативная активность клеток HL-60, инкубированных с препаратом рчГМ-КСФ в течение 72 ч, носила дозозависимый характер. Наиболее высокие значения повышения пролиферативной активности при увеличении дозы препарата наблюдались в диапазоне концентраций от 0,04 до 0,64 нг/мл (прирост значений показателя при двукратном увеличении дозы составлял 11–18%). В экспериментах на мышах продемонстрирован двухфазный характер дозовой зависимости эффекта. Наибольшую гемостимулирующую активность препарат проявлял в дозе 90 мкг/кг. Выводы: препарат рчГМ-КСФ, полученный по разработанной технологии, обладает выраженной гемостимулирующей активностью, подтвержденной в системах in vitro и in vivo.

1. Багрова СГ. Гранулоцитарные колониестимулирующие факторы в профилактике фебрильной нейтропении. Эффективная фармакотерапия. 2015;(31):6–15.

2. Мальцев ДВ. Показания к применению колониестимулирующих факторов в клинической практике. Клиническая иммунология, аллергология и инфектология. 2018;(1):5–12.

3. Половинкина ВС, Косоруков ВС. Рекомбинантный чГМКСФ в онкологии. Российский биотерапевтический журнал. 2009;8(1):29–39.

4. Газатова НД, Меняйло МЕ, Малащенко ВВ, Гончаров АГ, Мелащенко ОБ, Морозова ЕМ, Селедцов ВИ. Прямые эффекты гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора на функциональные свойства моноцитов/макрофагов человека. Медицинская иммунология. 2019;21(3):419–26. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2019-3-419-426

5. Warren TL, Weiner GJ. Uses of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in vaccine development. Curr Opin Hematol. 2000;7(3):168–73. https://doi.org/10.1097/00062752-200005000-00007

6. Белогурова МБ. Клиническое использование гемопоэтических ростовых факторов. Практическая онкология. 2003;4(3):183–90.

7. Francisco-Cruz A, Aguilar-Santelises M, Ramos-Espinosa O, Mata-Espinosa D, Marquina-Castillo B, Barrios-Payan J, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: not just another haematopoietic growth factor. Med Oncol. 2014;31(1):774. https://doi.org/10.1007/s12032-013-0774-6

8. Libby RT, Braedt G, Kronheim SR, March CJ, Urdal DL, Chiaverotti SR, et al. Expression and purification of native human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from an Escherichia coli secretion vector. DNA. 1987;6(3):221–9. https://doi.org/10.1089/dna.1987.6.221

9. Delamarter J, Ernst JF. Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and process for producing them in high yields in microbial cells. WO1987002060. 1987.

10. Есина ТИ, Лебедев ЛР, Волосникова ЕА, Гилева ИП, Гогина ЯС, Терещенко ТА и др. Способ получения рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. Биотехнология. 2019;35(3):68–73. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2019-35-3-68-73

11. Гилева ИП, Есина ТИ, Волосникова ЕА, Гогина ЯС, Лебедев ЛР, Даниленко ЕД. Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E. COLI SG 20050/ p280_2GM — продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида. Патент Российской Федерации № 2708556; 2019.

12. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248–54. https://doi.org/10.1006/abio.1976.9999

13. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680–5. https://doi.org/10.1038/227680a0

14. Yamaguchi T, Yamaguchi T, Kogi M, Yamamoto Y, Hayakawa T. Bioassay of human granulocyte colony-stimulating factor using human promyelocytic HL-60 cells. Biol Pharm Bull. 1997;20(9):943–7. https://doi.org/10.1248/bpb.20.943

15. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65(1–2):55–63. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4

16. Масычева ВИ, Даниленко ЕД, Шимина ГГ, Гвоздева ТС, Алямкина ЕА, Долгова ЕВ и др. Изучение гемостимулирующей активности нуклеопротеидного комплекса, выделенного из плаценты человека. Сибирский онкологический журнал. 2012;(5):34–8.

17. Новицкий ВВ, Евтушенко ОМ. Руководство к практическим занятиям по гематологии. Томск: Сибирский медицинский университет; 1999.

18. Гржибовский АМ. Анализ трех и более независимых групп количественных данных. Экология человека. 2008;(3):50–8.

19. Гражданцева АА, Сиволобова ГФ, Ткачева АВ, Гилева ИП, Кулигина ЕВ, Рихтер ВА, Кочнева ГВ. Высокоэффективная продукция биологически активного секретируемого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека рекомбинантным вирусом осповакцины. Биотехнология. 2015;31(5):13–21.

20. Веселовский ВА, Веселова ТВ, Чернавский ДС. Трехфазная (парадоксальная) дозовая зависимость реакции растительной клетки на факторы внешней среды. Российский химический журнал. 1999;43(5):49–54.

21. Parmiani G, Castelli C, Pilla L, Santinami M, Colombo MP, Rivoltini L. Opposite immune functions of GM-CSF administered as vaccine adjuvant in cancer patients. Ann Oncol. 2007;18(2):226–32. https://doi.org/10.1093/annonc/mdl158

22. Sun L, Rautela J, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Carrington EM, Schenk RL, et al. GM-CSF quantity has a selective effect on granulocytic vs. monocytic myeloid development and function. Front Immunol. 2018;9:1922.