Характеризация субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, полученного на основе штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE - продуцента эритропоэтина

Разработка и внедрение в клиническую практику препаратов рекомбинантного эритропоэтина человека (рчЭПО) продолжают оставаться актуальными в настоящее время. Для получения разрешения на проведение клинических исследований таблетированной формы рчЭПО для перорального применения проведены дополнительные исследования для подтверждения пригодности штамма-продуцента CHOpE для производства рчЭПО и соответствия характеристик субстанции требованиям, предъявляемым к ЭПО.

Цель работы: характеризация субстанции рчЭПО, полученной на основе клеток штамма продуцента СНОрЕ, в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ЭПО.

Материалы и методы: субстанцию рчЭПО получали при культивировании штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE. Экспрессирующую конструкцию штамма-продуцента оценивали с помощью методов определения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Секвенирование нуклеотидной последовательности, кодирующей ген ЭПО человека, проводили по методу Сэнгера. Аминокислотную последовательность С- и N-концов молекулы рчЭПО определяли методом Эдмана. Копийность гена ЭПО в клетках СНОрЕ определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Свойства субстанции рчЭПО изучали в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ЭПО. Подлинность субстанции рчЭПО определяли с помощью методов изоэлектрического фокусирования, пептидного картирования и электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения соотношения изоформного состава использовали метод капиллярного электрофореза. Для выявления примесей димеров и высокомолекулярных родственных веществ в субстанции применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления. Содержание белка и остаточных нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрическим методом. Концентрацию субстанции рчЭПО оценивали методом иммуноферментного анализа.

Результаты: подтверждена генетическая стабильность штамма-продуцента СHOpE, доказана идентичность аминокислотной последовательности N- и С-концов молекулы рчЭПО природному ЭПО. На основе штамма-продуцента СHOpE получена субстанция рчЭПО, которая является гомогенной и не содержит примесей олигомерных форм ЭПО. Димеры и высокомолекулярные родственные вещества составляют менее 0,5%. Молекулярная масса рчЭПО находится в диапазоне значений от 32 до 38 кДа, изоэлектрическая точка – от 2,8 до 4,15. Идентифицированы пики изоформ 1–8, изоформный состав субстанции рчЭПО соответствует ЭПО. Установлено, что в 1 моль субстанции содержится 13,75 моль сиаловых кислот.

Выводы: подтверждена пригодность штамма-продуцента СНОрЕ для производства рчЭПО. Полученная субстанция рчЭПО соответствует требованиям, предъявляемым к ЭПО.

1. Melli G, Jack C, Lambrinos GL, Ringkamp M, Höke A. Erythropoietin protects sensory axons against paclitaxel-induced distal degeneration. Neurobiol. Dis. 2006;24(3):525–30. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2006.08.014

2. Lisowska KA, Bryl E, Witkowski JM. Erythropoietin receptor is detectable on peripheral blood lymphocytes and its expression increases in activated T lymphocytes. Haematologica. 2011;96(3):e12–e13. https://doi.org/10.3324/haematol.2010.038414

3. Heeschen C, Aicher A, Lehmann R, Fichtlscherer S, Vasa M, Urbich C, et al. Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization. Blood. 2003;102(4):1340–6. https://doi.org/10.1182/blood-2003-01-0223

4. Savino C, Pedotti R, Baggi F, Ubiali F, Gallo B, Nava S, et al. Delayed administration of erythropoietin and its non-erythropoietic derivatives ameliorates chronic murine autoimmune encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 2006;172(1–2):27–37. https://doi.org/10.1016/j.jneuroim.2005.10.016

5. Киприянов СМ, Царева АА, Офицеров ВИ, Хромых ТИ, Сандахчиев ЛС. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSV-dEp-poly-NeO, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка CHOpE – продуцент эритропоэтина человека. Патент Российской Федерации № 2070931; 1996.

6. Радаева ИФ, Богрянцева МП, Нечаева ЕА. Банки культур клеток для биотехнологии. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012;(2):110–5.

7. Радаева ИФ, Колесова МЕ, Сереброва ВС, Вараксин НА, Рябичева ТГ, Жилина НВ, Нечаева ЕА. Разработка технологии получения лиофилизованной субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека. Биотехнология. 2013;29(2):67–73.

8. Сандахчиев ЛС, Колокольцова ТД, Костина НЕ, Нечаева ЕА, Юрченко НД, Рыжиков АБ и др. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения и способ ее получения. Патент Российской Федерации № 2152206; 2000.

9. Ханисов ВВ, Тритэк ВС, Акапов АБ, Буркитбаева СС, Джунушалиева ЧУ, Хасенбекова ЖР и др. Влияние субстанции рекомбинантного человеческого эритропоэтина на гематологические показатели в периферической крови. Биотехнология. Теория и практика. 2007;(2):101–8.

10. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463–7. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463

11. Lin FK, Suggs S, Lin CH, Browne JK, Smalling R, Egrie JC, et al. Cloning and expression of the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985;82(22):7580–4. https://doi.org/10.1073/pnas.82.22.7580

12. Малыгина ВС, Радаева ИФ, Нечаева ЕА, Дроздов ИГ. Изучение свойств культуры клеток CHOpE – продуцента эритропоэтина человека. Биотехнология. 2010;2:31–5.

13. Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G, Chasin LA. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75(11):5553–6. https://doi.org/10.1073/pnas.75.11.5553

14. Меркулов ВА, Солдатов АА, Авдеева ЖИ, Алпатова НА, Гайдерова ЛА, Яковлев АК и др. Препараты рекомбинантных эритропоэтинов и их характеристика. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2013;(3):4–11

15. Яковлев АК, Алешкин АВ, Меркулов ВА, Бондарев ВП. Совершенствование методики определения специфической активности эритропоэтина. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63(7):422–8.

16. Яковлев АК, Волкова РА, Симутенко ЛВ, Постнова ЕЛ, Батуашвили ТА, Воропаев АА и др. Разработка отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина. Химико-фармацевтический журнал. 2018;52(1):60–4.