Preview

БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение

Расширенный поиск

Характеризация субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, полученного на основе штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE - продуцента эритропоэтина

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-116-125

Полный текст:

Аннотация

Разработка и внедрение в клиническую практику препаратов рекомбинантного эритропоэтина человека (рчЭПО) продолжают оставаться актуальными в настоящее время. Для получения разрешения на проведение клинических исследований таблетированной формы рчЭПО для перорального применения проведены дополнительные исследования для подтверждения пригодности штамма-продуцента CHOpE для производства рчЭПО и соответствия характеристик субстанции требованиям, предъявляемым к ЭПО.

Цель работы: характеризация субстанции рчЭПО, полученной на основе клеток штамма продуцента СНОрЕ, в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ЭПО.

Материалы и методы: субстанцию рчЭПО получали при культивировании штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE. Экспрессирующую конструкцию штамма-продуцента оценивали с помощью методов определения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Секвенирование нуклеотидной последовательности, кодирующей ген ЭПО человека, проводили по методу Сэнгера. Аминокислотную последовательность С- и N-концов молекулы рчЭПО определяли методом Эдмана. Копийность гена ЭПО в клетках СНОрЕ определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Свойства субстанции рчЭПО изучали в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ЭПО. Подлинность субстанции рчЭПО определяли с помощью методов изоэлектрического фокусирования, пептидного картирования и электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения соотношения изоформного состава использовали метод капиллярного электрофореза. Для выявления примесей димеров и высокомолекулярных родственных веществ в субстанции применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления. Содержание белка и остаточных нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрическим методом. Концентрацию субстанции рчЭПО оценивали методом иммуноферментного анализа.

Результаты: подтверждена генетическая стабильность штамма-продуцента СHOpE, доказана идентичность аминокислотной последовательности N- и С-концов молекулы рчЭПО природному ЭПО. На основе штамма-продуцента СHOpE получена субстанция рчЭПО, которая является гомогенной и не содержит примесей олигомерных форм ЭПО. Димеры и высокомолекулярные родственные вещества составляют менее 0,5%. Молекулярная масса рчЭПО находится в диапазоне значений от 32 до 38 кДа, изоэлектрическая точка – от 2,8 до 4,15. Идентифицированы пики изоформ 1–8, изоформный состав субстанции рчЭПО соответствует ЭПО. Установлено, что в 1 моль субстанции содержится 13,75 моль сиаловых кислот.

Выводы: подтверждена пригодность штамма-продуцента СНОрЕ для производства рчЭПО. Полученная субстанция рчЭПО соответствует требованиям, предъявляемым к ЭПО.

Об авторах

И. Ф. Радаева
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Россия
Радаева Ирина Федоровна
р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559


В. А. Терновой
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Россия
Терновой Владимир Александрович, канд. биол. наук р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559


А. О. Семенцова
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Россия
Семенцова Александра Олеговна
р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559


Н. Б. Думченко
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Россия

Думченко Наталья Борисовна

р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559



Е. А. Нечаева
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Россия

Нечаева Елена Августовна, канд. мед. наук

р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559



Список литературы

1. Melli G, Jack C, Lambrinos GL, Ringkamp M, Höke A. Erythropoietin protects sensory axons against paclitaxel-induced distal degeneration. Neurobiol. Dis. 2006;24(3):525–30. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2006.08.014

2. Lisowska KA, Bryl E, Witkowski JM. Erythropoietin receptor is detectable on peripheral blood lymphocytes and its expression increases in activated T lymphocytes. Haematologica. 2011;96(3):e12–e13. https://doi.org/10.3324/haematol.2010.038414

3. Heeschen C, Aicher A, Lehmann R, Fichtlscherer S, Vasa M, Urbich C, et al. Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization. Blood. 2003;102(4):1340–6. https://doi.org/10.1182/blood-2003-01-0223

4. Savino C, Pedotti R, Baggi F, Ubiali F, Gallo B, Nava S, et al. Delayed administration of erythropoietin and its non-erythropoietic derivatives ameliorates chronic murine autoimmune encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 2006;172(1–2):27–37. https://doi.org/10.1016/j.jneuroim.2005.10.016

5. Киприянов СМ, Царева АА, Офицеров ВИ, Хромых ТИ, Сандахчиев ЛС. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSV-dEp-poly-NeO, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка CHOpE – продуцент эритропоэтина человека. Патент Российской Федерации № 2070931; 1996.

6. Радаева ИФ, Богрянцева МП, Нечаева ЕА. Банки культур клеток для биотехнологии. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012;(2):110–5.

7. Радаева ИФ, Колесова МЕ, Сереброва ВС, Вараксин НА, Рябичева ТГ, Жилина НВ, Нечаева ЕА. Разработка технологии получения лиофилизованной субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека. Биотехнология. 2013;29(2):67–73.

8. Сандахчиев ЛС, Колокольцова ТД, Костина НЕ, Нечаева ЕА, Юрченко НД, Рыжиков АБ и др. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения и способ ее получения. Патент Российской Федерации № 2152206; 2000.

9. Ханисов ВВ, Тритэк ВС, Акапов АБ, Буркитбаева СС, Джунушалиева ЧУ, Хасенбекова ЖР и др. Влияние субстанции рекомбинантного человеческого эритропоэтина на гематологические показатели в периферической крови. Биотехнология. Теория и практика. 2007;(2):101–8.

10. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463–7. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463

11. Lin FK, Suggs S, Lin CH, Browne JK, Smalling R, Egrie JC, et al. Cloning and expression of the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985;82(22):7580–4. https://doi.org/10.1073/pnas.82.22.7580

12. Малыгина ВС, Радаева ИФ, Нечаева ЕА, Дроздов ИГ. Изучение свойств культуры клеток CHOpE – продуцента эритропоэтина человека. Биотехнология. 2010;2:31–5.

13. Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G, Chasin LA. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75(11):5553–6. https://doi.org/10.1073/pnas.75.11.5553

14. Меркулов ВА, Солдатов АА, Авдеева ЖИ, Алпатова НА, Гайдерова ЛА, Яковлев АК и др. Препараты рекомбинантных эритропоэтинов и их характеристика. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2013;(3):4–11

15. Яковлев АК, Алешкин АВ, Меркулов ВА, Бондарев ВП. Совершенствование методики определения специфической активности эритропоэтина. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63(7):422–8.

16. Яковлев АК, Волкова РА, Симутенко ЛВ, Постнова ЕЛ, Батуашвили ТА, Воропаев АА и др. Разработка отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина. Химико-фармацевтический журнал. 2018;52(1):60–4.


Для цитирования:


Радаева И.Ф., Терновой В.А., Семенцова А.О., Думченко Н.Б., Нечаева Е.А. Характеризация субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, полученного на основе штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE - продуцента эритропоэтина. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;20(2):116-125. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-116-125

For citation:


Radaeva I.F., Ternovoy V.A., Sementsova A.O., Dumchenko N.B., Nechaeva E.A. Characterisation of Recombinant Human Erythropoietin Obtained from CHOpE—Erythropoietin Producing Strain of Chinese Hamster Ovary Cells. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2020;20(2):116-125. (In Russ.) https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-116-125

Просмотров: 77


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2221-996X (Print)
ISSN 2619-1156 (Online)