Интернализация рекомбинантной имиглюцеразы в перитонеальные макрофаги мыши и фибробласты мыши линии L929

Фермент-заместительная терапия (ФЗТ) является одной из самых действенных при лечении болезней лизосомального накопления. Болезнь Гоше первого типа характеризуется недостатком нативного фермента β-глюкоцереброзидазы, который возмещают внутривенными инфузиями рекомбинантного фермента (имиглюцераза). Клетками-мишенями имиглюцеразы являются макрофаги, в которые фермент проникает посредством взаимодействия с рецепторами маннозы на клеточной мембране. Оценка интернализации ферментов клетками-мишенями представляет интерес при разработке новых и воспроизведении существующих препаратов для ФЗТ. Для этих исследований широко применяются перитонеальные и альвеолярные макрофаги, макрофаги селезенки мелких лабораторных животных (крыс и мышей). Однако получение таких клеток затрагивает этические вопросы использования лабораторных животных. Альтернативой являются перевиваемые клеточные линии млекопитающих. Цель работы: провести сравнительные исследования интернализации рекомбинантной имиглюцеразы в перитонеальные макрофаги мыши и фибробласты мыши линии L929. Материалы и методы: Церезим^®, серии 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Джензайм Лтд., Великобритания); Глуразим, серии 020416, 011117, 021117 (ООО «МБЦ «Генериум», Россия). В работе использовали перитонеальные макрофаги, полученные от мышей линии BALB/c, и фибробласты мыши линии L929. Клетки культивировали в полной ростовой среде ДМЕМ/Ф12 c добавлением 10% сыворотки плода крупного рогатого скота. Активность имиглюцеразы, проникшей в клетки, оценивали спектрофотометрически по гидролизу искусственного субстрата 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида. Результаты: представлены данные сравнительной оценки интернализации рекомбинантной имиглюцеразы, действующего вещества препаратов Церезим^® и Глуразим, перитонеальными макрофагами мыши и клетками фибробластов мыши линии L929. Показано, что активность препаратов в лизатах перитонеальных макрофагов сопоставима с их активностью в лизатах клеток фибробластов мыши линии L929, при этом активность разработанного препарата Глуразим независимо от типа клеток, была в границах допустимого диапазона (80–125%), установленного для биоподобных препаратов. Выводы: экспериментально доказано, что фибробласты мыши линии L929 могут быть рекомендованы для оценки интернализации рекомбинантной имиглюцеразы.

1. Zimran A. How I treat Gaucher disease. Blood. 2011;118(6): 1463–71. https://doi.org/10.1182/blood-2011-04-308890

2. Dekker N, van Dussen L, Hollak CE, Overkleeft H, Scheij S, Ghauharali K, et al. Elevated plasma glucosylsphingosine in Gaucher disease: relation to phenotype, storage cell markers, and therapeutic response. Blood. 2011;118(16):118–27. https://doi.org/10.1182/blood-2011-05-352971

3. Sato Y, Beutler E. Binding, internalization, and degradation of mannose-terminated glucocerebrosidase by macrophages. J Clin Invest. 1993;91(5):1909–17. https://doi.org/10.1172/JCI116409

4. Friedman B, Vaddi K, Preston C, Mahon E, Cataldo JR, McPherson JM. A comparison of the pharmacological properties of carbohydrate remodeled recombinant and placental-derived beta-glucocerebrosidase: implications for clinical efficacy in treatment of Gaucher disease. Blood. 1999;93(9):2807–16.

5. Novo JB, Morganti L, Moro AM, Paes Leme AF, Serrano SM, Raw I, Ho PL. Generation of a Chinese hamster ovary cell line producing recombinant human glucocerebrosidase. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:875383. http://doi.org/10.1155/2012/875383

6. Zhu Y, Li X, Schuchman EH, Desnick RJ, Cheng SH. Dexamethasone-mediated up-regulation of the mannose receptor improves the delivery of recombinant glucocerebrosidase to Gaucher macrophages. J Pharmacol Exp Ther. 2004;308(2):705–11. https://doi.org/10.1124/jpet.103.060236

7. Simmons BM, Stahl PD, Russell JH. Mannose receptormediated uptake of ricin toxin and ricin A chain by macrophages. Multiple intracellular pathways for a chain translocation. J Biol Chem. 1986;261(17):7912–20.

8. Brumshtein B, Salinas P, Peterson B, Chan V, Silman I, Sussman JL, et al. Characterization of gene-activated human acid-β-glucosidase: crystal structure, glycan composition, and internalization into macrophages. Glycobiology. 2010;20(1):24–32. https://doi.org/10.1093/glycob/cwp138

9. Shaaltiel Y, Bartfeld D, Hashmueli S, Baum G, Brill-Almon E, Galili G, et al. Production of glucocerebrosidase with terminal mannose glycans for enzyme replacement therapy of Gaucher’s disease using a plant cell system. Plant Biotechnol J. 2007;5(5):579–90. https://doi.org/10.1111/j.14677652.2007.00263.x

10. Tekoah Y, Tzaban S, Kizhner T, Hainrichson M, Gantman A, Golembo M, et al. Glycosylation and functionality of recombinant β-glucocerebrosidase from various production systems. Biosci Rep. 2013;33(5):e00071. https://doi.org/10.1042/BSR20130081

11. Carballo-Uicab G, Linares-Trejo JE, Mellado-Sanchez G, Lopez-Morales CA, Velasco-Velazquez M, Pavon L, et al. Validation of a cell proliferation assay to assess the potency of a dialyzable leukocyte extract intended for batch release. Molecules. 2019;24(19):E3426. https://doi.org/10.3390/molecules24193426

12. Mejia-Calvo I, Munoz-Garcia L, Jimenez-Uribe A, CamachoSandoval R, Gonzalez-Gonzalez E, Mellado-Sanchez G, et al. Validation of a cell-based colorimetric reporter gene assay for the evaluation of Type I Interferons. Biotechnol Rep (Amst). 2019;22:e00331. https://doi.org/10.1016/j.btre.2019.e00331

13. Azad AK, Rajaram MVS, Schlesinger LS. Exploitation of the macrophage mannose receptor (CD206) in infectious disease diagnostics and therapeutics. J Cytol Mol Biol. 2014;10(1):1000003. https://doi.org/10.13188/23254653.1000003

14. Van Patten SM, Hughes H, Huff MR, Piepenhagen PA, Waire J, Qiu H, et al. Effect of mannose chain length on targeting of glucocerebrosidase for enzyme replacement therapy of Gaucher disease. Glycobiology. 2007;17(5):467–78. https://doi.org/10.1093/glycob/cwm008