Высокопатогенные вирусы птичьего гриппа вызывают серьезную обеспокоенность из-за их пандемического потенциала. Основные риски связаны с возможностью мутаций, которые могут привести к устойчивой передаче вируса от человека к человеку. В настоящее время случаи передачи птичьего гриппа, как правило, связаны с тесным контактом с инфицированными животными [1][2]. По данным Всемирной организации здравоохранения, по состоянию на 22.01.2026 зафиксировано 993 случая заражения людей вирусом гриппа H5N1, из которых 477 привели к смертельному исходу1.

В 2024 г. вирус гриппа подтипа H5N1 клады 2.3.4.4b был впервые выявлен у молочного скота. За этим последовало документирование первого случая межвидовой передачи от крупного рогатого скота к работникам молочных ферм [3][4]. Вирусологические и эпидемиологические исследования показали, что штамм A/Texas/37/2024, передавшийся от животных человеку, характеризуется повышенной вирулентностью и трансмиссивностью. Эксперименты на мышах и хорьках подтвердили возможность его передачи воздушно-капельным путем. Кроме того, штамм A/Texas/37/2024 содержит ключевую адаптационную аминокислотную замену E627K в белке полимеразного комплекса PB2, связанную с повышением репродукции вируса в клетках млекопитающих [5][6], что потенциально повышает риск дальнейшей адаптации патогена к хозяину.

Быстрая эволюция высокопатогенных вирусов гриппа птиц требует разработки гибких и оперативных мер профилактики. В этом контексте мРНК-вакцины рассматриваются как перспективная платформа для быстрого реагирования на возможные новые вспышки. мРНК-вакцины неинфекционны, эффективно индуцируют клеточный и гуморальный иммунный ответ, а их производство может быть налажено в кратчайшие сроки. В настоящее время во всем мире активно разрабатываются мРНК-вакцины для профилактики различных инфекционных заболеваний [7][8].

Одним из важных вопросов, который нужно решить при разработке мРНК-вакцины, является выбор способа ее внутриклеточной доставки. Липидные наночастицы (LNP) — наиболее распространенный метод доставки мРНК-вакцин. LNP обычно состоят из четырех липидных компонентов, которые обеспечивают эффективную инкапсуляцию и высвобождение мРНК, длительный период циркуляции в организме и стабильность комплекса. Дополнительным преимуществом LNP является адъювантный эффект, усиливающий иммунный ответ на вакцину. Однако для LNP характерен ряд недостатков, таких как токсичность, нежелательные явления и реактогенность [9][10].

В последнее время все больше внимания уделяется альтернативному методу доставки — методу струйной инжекции (СИ), который основан на внутрикожной инъекции под высоким давлением, при этом физическое воздействие на клеточную мембрану повышает ее проницаемость для нуклеиновых кислот. Кроме того, широкое распределение препарата в дерме способствует поглощению мРНК антигенпрезентирующими клетками, что еще больше повышает его иммуногенность. СИ позволяет эффективно доставлять неинкапсулированную мРНК в клетки, что исключает недостатки, связанные с LNP [11].

В рамках наших предыдущих исследований была создана экспериментальная мРНК-вакцина mRNA-H5 для профилактики заболевания, вызываемого высокопатогенным вирусом гриппа птиц подтипа H5Nx. В экспериментах на мышах линии BALB/c продемонстрирована ее высокая иммуногенность [11]. Мышей традиционно используют в качестве модели для изучения патогенеза вируса гриппа, и они имеют ряд преимуществ перед другими лабораторными животными, в том числе низкую стоимость содержания [12]. Однако многие клинические признаки заражения вирусом гриппа, характерные для людей, не проявляются у мышей, что ограничивает применимость этой модели для изучения передачи вируса и течения заболевания [13].

Хорьки как модель являются «золотым стандартом» для оценки доклинической эффективности вакцин и воздушно-капельной передачи вирусов гриппа [14]. Хорьки имеют схожие с людьми физиологию легких, клинические признаки инфекции и распределение клеточных рецепторов сиаловой кислоты в дыхательных путях, что играет важную роль в репликации и проникновении вируса в клетку [15][16]. Высокая восприимчивость хорьков к вирусу гриппа и способность больных животных передавать вирус здоровым были впервые продемонстрированы в 1933 г. С тех пор хорьки стали незаменимыми в экспериментальных исследованиях, направленных на изучение взаимодействия вируса с организмом хозяина [17]. Например, на модели хорьков проведены исследования мРНК-вакцин для борьбы с заболеванием, вызываемым вирусом гриппа H5N1 [18][19].

Цель работы — изучение иммуногенных и протективных свойств экспериментальной мРНК-вакцины mRNA-H5 на модели хорьков.

Материалы

Плазмиды. Для синтеза мРНК-вакцины mRNA-H5 использовали плазмиду pVAX-Cas1CC-H5, полученную ранее в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора [11].

Вирусные штаммы. В реакции вируснейтрализации был использован штамм вируса гриппа A/turkey/Stavropol/320-01/2020 (H5N8) (EPI_ISL_1114749) (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). При исследовании протективных свойств мРНК-вакцины mRNA-H5 использовали штамм вируса гриппа A/dalmatian pelican/Kalmykia/330-10V/2023 (H5N1) (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора).

Культуры клеток. Использована культура клеток MDCK-SIAT1 (Коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Клетки выращивали на среде DMEM (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10% фетальной коровьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В. При работе с вирусом использовали поддерживающую среду: среда DMEM, 0,2% бычьего сывороточного альбумина; 2 мкг/мл трипсин TPCK (Sigma-Aldrich); 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В.

Животные. В работе использовали 8–10 мес. половозрелых самок беспородных хорьков (Mustela putorius furo) весом 700–1500 г (ООО «Кэра», Россия). Работу с животными проводили в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных»2 и с соблюдением принципов гуманности в соответствии с протоколами, утвержденными Биоэтическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Протокол № 3 от 03.04.2025). Более подробное описание экспериментов на животных приведено в Приложении 1 (размещено на сайте журнала3).

Методы

Синтез мРНК in vitro

Подготовку матрицы для синтеза мРНК и синтез мРНК проводили по ранее описанному протоколу [11]. В качестве матрицы для синтеза мРНК использовали генетическую конструкцию pVAX-Cas1CC-H5, несущую целевой ген под контролем Т7-промотора, который был модифицирован для правильного присоединения AG-Cap-аналога. Перед процедурой получения мРНК плазмида была линеаризована с использованием эндонуклеазы рестрикции EcoRI (ООО «СибЭнзайм», Россия). Условия реакции (температура, состав буфера и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК) подбирали в соответствии с инструкциями производителя. Для очистки линейной формы плазмиды pVAX-Cas1CC-H5 был проведен электрофорез в 1% агарозном геле с последующим выделением продукта из геля с использованием набора «HiPure Gel DNA Mini Kit» (Magen, Китай).

Синтез мРНК проводили с использованием набора T7 High Yield RNA Synthesis Kit (Yeasen, Китай). Реакционная смесь содержала 1 мкг линеаризованной матрицы; Т7-полимеразу с буфером; AG-Cap-аналог кэпа m7GmAmG («Биолабмикс», Россия) (6 мМ); смесь рибонуклеозидтрифосфатов (7 мМ), в которой уридин был заменен на N1-метилпсевдоуридин; ингибитор РНКаз («БелБиоЛаб», Россия) и безнуклеазную воду. Смесь инкубировали в течение 3 ч при температуре 37 °С. После инкубации в смесь добавляли 1 мкл ДНКазы I (1 ед. активности/мкл) (Thermo Fisher Scientific, США) и инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С для разрушения ДНК-матрицы. Выделение синтезированной мРНК из реакционной смеси проводили с помощью осаждения 5М аммония ацетатом, инкубации при минус 20 °C в течение 1 ч и последующей промывки 70% этанолом. Осадок мРНК подсушивали при комнатной температуре и растворяли в безнуклеазной воде.

Получение липидных наночастиц (LNP)

LNP получали методом быстрого микрофлюидного смешивания водной и органической фаз. Водная фаза содержала мРНК mRNA-H5 в 100 мМ цитратном буфере (pH 4). Органическая фаза представляла собой смесь растворенных в 96% этаноле липидов в молярном процентном соотношении: ионизируемый липид SM-102 — 50%; нейтральный фосфолипид DSPC — 10%; холестерин — 38,5%; ПЭГ-липид (DMG-PEG2000) — 1,5%. Препараты липидов были получены от AVT Pharmaceutical Tech Co. (КНР). Фазы смешивали с использованием прибора Automated NP System (Dolomite Microfluidics, Великобритания).

Иммунизация хорьков мРНК-вакциной mRNA-H5

Для иммунизации использовали самок хорьков весом 700–1500 г. Препараты mRNA-Н5 LNP и рекомбинантного белка HA/H5 в 100 мкл фосфатно-солевого буфера — ФСБ (pH 7,4) вводили в четырехглавую мышцу бедра с помощью инсулиновых шприцев с иглой 29G. Препараты мРНК-вакцины, растворенные в 50 мкл ФСБ, вводили в область левой задней лапы методом СИ с помощью инжектора Comfort-IN (Comfort-IN, Австралия) с использованием индивидуальных насадок-сопло. Животные были распределены в 4 группы по 6 животных: группа 1 — введение мРНК-вакцины mRNA-H5 в дозе 100 мкг с помощью СИ; группа 2 — введение mRNA-H5 в дозе 30 мкг в составе LNP внутримышечно; группа 3 — введение рекомбинантного белка HA/H5 с гидроокисью алюминия в дозе 15 мкг внутримышечно; группа 4 — введение физиологического раствора внутримышечно (интактные животные). Размер данной выборки обусловлен тем, что в исследовании прототипы вакцины оценивались in vivo на модели хорьков впервые и целью был сбор первоначальных данных для дальнейших экспериментов с бóльшим размером выборки. Иммунизацию осуществляли двукратно с интервалом 28 сут. Через 21 сут после второй иммунизации осуществляли забор венозной крови для оценки гуморального и клеточного иммунного ответа.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

В качестве антигена для ИФА использовали рекомбинантный эукариотический белок HA/H5, сорбированный на поверхности 96-луночных планшетов в концентрации 1 мкг/мл в 2 М мочевине в течение ночи при 4 °С [20]. ИФА проводили по методике, описанной в работе [21]. Лунки планшетов трижды промывали и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре с 1% казеина в ФСБ с добавлением 0,05% Tween 20 (ФСБ-Т) для блокирования неспецифического связывания белка. Затем планшеты инкубировали с трехкратными серийными разведениями сыворотки иммунизированных животных в течение 1 ч при комнатной температуре, после промывки ФСБ-Т добавляли вторичные козьи антитела против иммуноглобулина G хорька, меченные пероксидазой хрена (Abcam, Великобритания) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После окончательной промывки в планшеты добавляли субстрат TMB (Amresco, США). Реакцию останавливали 1N HCl и проводили измерение оптической плотности на приборе Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific) при длине волны 450 нм. Конечный титр определяли по последнему разведенному образцу, давшему положительные результаты по значению оптической плотности.

Определение вируснейтрализующей активности иммунных сывороток

В работе использовали штамм вируса гриппа A/turkey/Stavropol/320-01/2020 (H5N8). Сыворотки крови иммунизированных хорьков обрабатывали ферментом RDE (Denka Seiken, Япония) для удаления неспецифических ингибиторов, содержащих сиаловую (нейраминовую) кислоту, которые могут имитировать действие антител, связываясь с вирусом гриппа. Сыворотки инактивировали нагреванием в течение 30 мин при температуре 56 °C. Рабочая доза вируса составляла 100 TCID50/100 мкл вирусного разбавителя (среда DMEM c добавлением 0,2% бычьего сывороточного альбумина (Gibco), 1% пенициллина-стрептомицина и 2 мкг/мл TPCK-трипсина). В 96-луночных серологических планшетах готовили двукратные разведения сыворотки в 100 мкл поддерживающей среды, затем в каждую лунку вносили 100 мкл рабочего разведения вируса (общий объем 200 мкл) и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °C и 5% CO2. В качестве контроля использовали сыворотку интактных хорьков. После этого 180 мкл суспензии переносили в лунки 96-луночного планшета с клеточной культурой MDCK-SIAT1 и инкубировали в течение 3 сут при температуре 37 °C и 5% CO2. После инкубации клетки окрашивали раствором кристаллического фиолетового и анализировали с помощью Agilent BioTek Cytation 5 (Thermo Fisher Scientific). Титр сыворотки в тесте на нейтрализацию вируса соответствовал разведению сыворотки, при котором остается 50% живых клеток. В контрольной группе оставалось не более 5% живых клеток [21].

Оценка Т-клеточного ответа методом ELISpot

Т-клеточный иммунный ответ определяли с помощью метода ELISpot с использованием набора ELISpot Plus: Ferret IFN-γ (ALP) (Mabtech, Швеция). Через 3 нед. после второй иммунизации осуществляли забор крови у иммунизированных хорьков. После лизиса эритроцитов буфером ACK Lysing Buffer (BD, США) Т-лимфоциты дважды отмывали в среде RPMI и помещали в 1 мл среды RPMI с 2 мМ L-глутамина и 50 мкг/мл гентамицина. На 96-луночном планшете из набора были иммобилизованы антитела против интерферона гамма (IFN-γ) хорька. После блокировки планшета RPMI Т-лимфоциты пассировали в количестве 5×10⁵ клеток/лунка и стимулировали пулом вирус-специфических пептидов PepMix (JPT, Германия). Клетки инкубировали в течение 20 ч при температуре 37 °С в атмосфере 5% CO2. Плашки затем отмывали, добавляли биотинилированные антитела против IFN-γ хорька, которые проявляли с помощью конъюгата «стрептавидин — пероксидаза хрена» и субстрата AEC (3-амино-9-этилкарбазол). Число IFN-γ-продуцирующих клеток подсчитывали с помощью системы для ELISpot-анализа на базе стереомикроскопа (Carl Zeiss, Германия) [21].

Изучение протективных свойств мРНК-вакцины

Все исследования по оценке защитных свойств вакцины проводили в соответствии с требованиями СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных заболеваний». Через 21 сут после второй иммунизации хорьков заражали интраназально 5 LD50 штамма вируса гриппа A/dalmatian pelican/Kalmykia/330-10V/2023 (H5N1) для изучения протективных свойств мРНК-вакцины mRNA-H5. Заражение осуществляли под наркозом с использованием смеси зарегистрированных ветеринарных препаратов Золетил 100 (Франция) и Ксила (Нидерланды). В течение 14 сут после заражения регистрировали физиологические реакции, смертность животных и измеряли их вес. В случаях, когда у животных развивались тяжелые состояния, несовместимые с жизнью, при которых животное не могло нормально жить и питаться, а также при потере более 20% первоначальной массы тела, животное выводили из эксперимента. Всех остальных животных гуманно выводили из эксперимента при его завершении.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, США). Количественные данные представлены в виде среднего арифметического значения со стандартным отклонением и проанализированы с помощью непараметрических тестов. Межгрупповые различия оценивали с помощью непараметрического одностороннего дисперсионного анализа (критерия Краскела — Уоллиса) с post-hoc тестом Данна. Моделирование функции выживания проводилось с использованием метода Каплана — Мейера [21].

В предыдущих исследованиях мы провели молекулярный дизайн модифицированного гемагглютинина штамма вируса гриппа A/turkey/Stavropol/320-01/2020 (H5N8): удалены трансмембранный и цитоплазматический домены для получения секретируемого белка; заменен сайт протеолиза высокопатогенного вируса гриппа; внесены аминокислотные замены для повышения стабильности белка. На основе спроектированного иммуногена была получена мРНК-вакцина mRNA-H5, кодирующая модифицированный гемагглютинин вируса гриппа. Показана эффективная стимуляция гуморального и Т-клеточного ответа у мышей линии BALB/c на введение мРНК-вакцины методом СИ или в составе LNP. Вакцина mRNA-H5, введенная методом СИ или в составе LNP, обеспечила 100% защиту иммунизированных мышей от гибели при заражении летальными дозами штаммов вируса птичьего гриппа A/Astrakhan/3212/2020 (H5N8) и A/chicken/Magadan/14-7V/2022 (H5N1) [11].

В настоящем исследовании изучали иммуногенные и протективные свойства mRNA-H5 на модели хорьков. Получение мРНК-вакцины mRNA-H5, а также получение комплексов mRNA-H5 LNP проводили согласно ранее описанному протоколу [11]. В ходе анализа данных иммуногенности мРНК-вакцины, полученных на мышах линии BALB/c, и анализа литературных данных были выбраны дозы для разных методов введения mRNA-H5 — 100 мкг в случае использования СИ и доза 30 мкг в случае LNP. Хорьков двухкратно иммунизировали препаратами mRNA-H5 в указанных дозах методом СИ и в комплексе с LNP. В качестве положительного контроля хорькам вводили рекомбинантный белок HA/H5. Сыворотки иммунизированных животных исследовали с помощью ИФА. Титры специфических антител были выявлены у животных, иммунизированных mRNA-H5 с помощью СИ и в составе LNP и животных, иммунизированных рекомбинантным белком HA/H5; средние титры антител в группах составили 1:180 000, 1:4 000 000 и 1:1 800 000 соответственно (рис. 1А).

Сыворотки крови иммунизированных хорьков далее анализировали в реакции вируснейтрализации в отношении штамма вируса гриппа A/turkey/Stavropol/320-01/2020 (H5N8). Сыворотки крови животных, иммунизированных mRNA-H5 с помощью СИ и в составе LNP, а также сыворотки животных, иммунизированных рекомбинантным белком HA/H5, обладают вируснейтрализующей активностью; средние 50% нейтрализующие титры составили 1:250, 1:1500 и 1:1900 соответственно (рис. 1B).

Формирование Т-клеточного иммунитета у хорьков было изучено с помощью метода ELISpot. Для этого из образцов крови иммунизированных хорьков выделяли T-лимфоциты и оценивали их способность выделять IFN-γ в ответ на стимуляцию пептидами, входящими в состав гемагглютинина вируса. У хорьков, иммунизированных mRNA-H5 и рекомбинантным белком HA/H5, активируется специфический Т-клеточный иммунитет, что выражается в значительном повышении количества лимфоцитов, продуцирующих IFN-γ (>15 SFCs) (рис. 1C).

Анализ результатов изучения иммуногенности показывает, что наблюдается тенденция к более высокому уровню гуморального ответа в случае доставки мРНК в составе LNP, но при этом в случае доставки методом СИ есть тенденция к более высокому уровню клеточного ответа. Активация клеточного ответа может объясняться тем, что введение мРНК методом СИ обеспечивает широкое распределение препарата в эпидермисе и дерме, в которых плотность антигенпрезентирующих клеток выше, чем в мышечной ткани, тогда как при доставке в составе LNP мРНК поглощается в основном клетками мышц [22].

Не установлено статистически значимых различий титров специфических антител (данные ИФА и реакции вируснейтрализации) и в количестве T-лимфоцитов (данные ELISpot) между группой хорьков, иммунизированных мРНК-вакциной, и группой положительного контроля. В то же время были показаны статистически значимые различия при сравнении с группой интактных хорьков. Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности активации вирус-специфического гуморального и клеточного иммунного ответа у хорьков, иммунизированных mRNA-H5, в случае доставки методом СИ или в комплексе с LNP.

Для анализа протективных свойств был выбран циркулировавший на территории России штамм вируса гриппа A/dalmatian pelican/Kalmykia/330-10V/2023 (H5N1). Через 21 сут после второй иммунизации хорьки были заражены данным штаммом в дозе 5 LD50. В течение 14 сут после заражения регистрировали физиологические реакции, смертность животных и измеряли их вес (рис. 2А). Выживаемость всех иммунизированных животных составила 100%, клинические признаки заболевания отсутствовали (рис. 2B). В группе интактных животных выжило 2 из 6 хорьков (33%), остальные животные были выведены из эксперимента из-за сильной (>20%) потери веса или неврологических симптомов; у всех интактных хорьков наблюдались явные признаки заболевания, такие как плохой аппетит, хрипение и чихание, выделения из носа на внешней стороне, атаксия.

Впервые на модели хорьков продемонстрированы иммуногенные и протективные свойства мРНК-вакцины mRNA-H5, кодирующей модифицированный гемагглютинин штамма вируса гриппа A/turkey/Stavropol/320-01/2020 (H5N8). Важный аспект данного исследования заключается в сравнении эффективности двух разных способов доставки мРНК-вакцины (СИ и в составе LNP) в одном эксперименте. Для обоих способов показано сопоставимое формирование защитного иммунитета у животных при заражении вирусом гриппа (рис. 2). В группе с введением mRNA-H5 методом СИ установлены более низкие вируснейтрализующие титры (рис. 1B) по сравнению с группой mRNA-H5 LNP, но при этом наблюдалась тенденция к увеличению уровня T-клеточного ответа (рис. 1C). Это позволяет предположить, что для формирования протективного иммунитета очень важна эффективная активация не только гуморального, но и T-клеточного ответа. Необходимо отметить, что неинкапсулированная мРНК, введенная струйным инжектором, способствует обеспечению защитного иммунитета без использования LNP, имеющих ряд недостатков [9][10]. Описанные выше данные согласуются с данными нашей предыдущей работы на мышах [11] и являются продолжением изучения mRNA-H5 на другой модели животных — хорьках, которые представляют собой более релевантную модель для исследования патогенеза вируса гриппа. Таким образом, мРНК-вакцина mRNA-H5 является перспективным вакцинным кандидатом для профилактики заболевания, вызываемого высокопатогенным вирусом гриппа птиц подтипа H5Nx.

Необходимо отметить следующие ограничения данного исследования. На хорьках была исследована только одна доза мРНК для каждого метода доставки (100 мкг для СИ и 30 мкг для LNP), выбранная на основании экспериментальных данных на мышах и анализа данных литературы; целесообразен анализ дозозависимого эффекта mRNA-H5 на хорьках и более тщательный подбор дозы. Протективные свойства вакцины изучены только на гомологичном штамме вируса гриппа и в дозе 5 LD50; необходимо изучение на более широком спектре штаммов и диапазоне доз. Дальнейшая работа будет направлена на преодоление указанных ограничений.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» опубликовано Приложение 1.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-3-276-286-annex

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: В.Р. Литвинова, А.С. Гудымо, В.А. Яковлев, Т.Н. Ильичёва, В.Ю. Марченко, Л.И. Карпенко, А.А. Ильичёв, А.П. Рудомётов — концепция работы, написание текста рукописи, формулировка выводов; М.Б. Боргоякова, Е.В. Старостина, Е.В. Яковлева, К.И. Иванова, О.Н. Перфильева, К.П. Макарова, Д.И. Вахи тов, Н.В.мДанильченко, М.Л. Егорова, Н.Н. Васильцова — получение экспериментальных данных; С.В. Шарабрин, Н.Б. Рудомётова, Д.Н. Кисаков, Л.А. Кисакова — участие в формулировке выводов, утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Соответствие принципам этики. Эксперименты с животными проводили с соблюдением принципов гуманности в соответствии с протоколами, утвержденными Биоэтическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Протокол № 3 от 03.04.2025).

Использование генеративного искусственного интеллекта. Авторы заявляют, что не использовали генеративный ИИ при подготовке рукописи.

Supplementary information. Supplementary material 1 is available on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-3-276-286-annex

Author contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. V.R. Litvinova, A.S. Gudymo, V.A. Yakovlev, T.N. Ilyicheva, V.Yu. Marchenko, L.I. Karpenko, A.A. Ilyichev, A.P. Rudometov conceptualized the study, drafted the manuscript, and formulated the conclusions. M.B. Borgoyakova, E.V. Starostina, E.V. Yakovleva, K.I. Ivanova, O.N. Perfilyeva, K.P. Makarova, D.I. Vahitov, N.V. Danilchenko, M.L. Egorova, N.N. Vasil­tsova contributed to the acquisition of experimental data. S.V. Sharabrin, N.B. Rudometova, D.N. Kisakov, L.A. Kisakova participated in formulating the conclusions and approved the final version of the manuscript for publication.

Ethics approval. Animal experiments were conducted in compliance with humane principles and in accordance with the protocols approved by the Bioethics Committee of the Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” (Protocol No. 3 dated April 3, 2025).

Use of generative artificial intelligence. The authors declare that they did not use generative AI in the preparation of this manuscript.

1. Human infection with avian influenza A(H5) viruses. Avian influenza weekly update No. 1040. WHO; 2026.2. ГОСТ 33216-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами.3. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-3-276-286-annex