biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2026-26-2-220-229biopreparat-751Research ArticleСТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВАSTANDARDIZATION AND QUALITY CONTROLАттестация фармакопейного стандартного образца лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзииCertification of a pharmacopoeial reference standard of lyophilized IgE-containing serum to ragweed pollen allergenhttps://orcid.org/0000-0001-5371-8532НевскаяЛ. В.NevskayaL. V.
Невская Лариса Валерьевна, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Larisa V. Nevskaya, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051
Nevskaya@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7333-1076ПетроваН. Э.PetrovaN. E.
Петрова Надежда Эдуардовна, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Nadezhda E. Petrova, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051
https://orcid.org/0000-0001-8422-3452КапитановаВ. К.KapitanovaV. K.
Капитанова Вера Константиновна
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Vera K. Kapitanova
8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051
https://orcid.org/0000-0002-6176-5934ГайдероваЛ. А.GaiderovaL. A.
Гайдерова Лидия Александровна, канд. мед. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Lidiya A. Gaiderova, Cand. Sci. (Med.)
8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051
https://orcid.org/0000-0002-8473-7442ФадейкинаО. В.FadeikinaO. V.
Фадейкина Ольга Васильевна, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Olga V. Fadeikina, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияScientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsRussian Federation202604072026262220229Copyright © Невская Л.В., Петрова Н.Э., Капитанова В.К., Гайдерова Л.А., Фадейкина О.В., 20262026Невская Л.В., Петрова Н.Э., Капитанова В.К., Гайдерова Л.А., Фадейкина О.В.Nevskaya L.V., Petrova N.E., Kapitanova V.K., Gaiderova L.A., Fadeikina O.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/751ВВЕДЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ. Для оценки активности аллергенов методом конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) требуются стандартные образцы (СО) специфических сывороток, содержащих IgE-антитела к аллергену пыльцы амброзии полыннолистной. Однако международный и национальный стандарты такой сыворотки отсутствуют. Актуальной представляется разработка российского фармакопейного стандартного образца (ФСО) IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии.
ЦЕЛЬ
ЦЕЛЬ. Аттестация кандидата в ФСО лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии (ФСО IgE-Амб) и оценка возможности его применения для определения концентрации IgE и активности аллергена.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Концентрацию аллергенспецифических IgE-антител в ФСО IgE-Амб определяли методом реверсивного аллергосорбентного теста (РЕАСТ) с помощью коммерческого набора реагентов российского производства. Подлинность ФСО IgE-Амб определяли согласно ОФС.1.7.2.0034.15 методом прямого ИФА. Испытания кандидата в ФСО по показателям качества «Описание», «Вода», «Однородность массы», «Растворимость», «Герметичность» проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ). Аллергенную активность оценивали методом конкурентного ИФА. Статистическую обработку данных проводили с использованием дисперсионного анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ. Аттестация кандидата в ФСО IgE-Амб проведена согласно утвержденной программе аттестации. Методом РЕАСТ определена аттестуемая характеристика ФСО IgE-Амб — концентрация специфических IgE-антител к аллергену пыльцы амброзии, составившая 27,02±4,6 МЕ/мл (4-й класс). Подтверждена специфичность связывания ФСО IgE-Амб с аллергеном пыльцы амброзии полыннолистной. Результаты испытаний кандидата в ФСО по дополнительным показателям качества («Описание», «Вода», «Однородность массы», «Растворимость», «Герметичность») соответствовали требованиям ГФ РФ. Показана возможность использования ФСО IgE-Амб для определения концентрации IgE-антител в референс-сыворотках предприятия методом прямого ИФА и оценки активности аллергена пыльцы амброзии методом конкурентного ИФА. Коэффициенты вариации между известным и определенными с помощью ФСО значениями составили 4,7% для прямого ИФА и 8,0% для конкурентного ИФА.
ВЫВОДЫ
ВЫВОДЫ. Впервые аттестован российский ФСО лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии с установленной характеристикой — концентрацией специфических IgE-антител к аллергену пыльцы амброзии полыннолистной, определенной методом РЕАСТ. ФСО IgE-Амб соответствует требованиям ГФ РФ, рекомендован для включения в Реестр фармакопейных стандартных образцов ГФ РФ и обеспечивает возможность стандартизации аллергенов и референс-сывороток в Российской Федерации.
INTRODUCTION
INTRODUCTION. The assessment of allergen activity by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) requires reference standards (RS) of specific sera containing IgE antibodies to the common ragweed pollen allergen. However, neither an international nor a national standard for such serum is available. Therefore, the development of a Russian pharmacopoeial reference standard (PhRS) for IgE-containing serum to common ragweed pollen allergen is relevant.
AIM
AIM. This study aimed to certify a candidate for the pharmacopoeial reference standard of lyophilized IgE-containing serum to common ragweed pollen allergen (PhRS IgE-Amb) and to evaluate the feasibility of its use for determining IgE concentration and allergen activity.
MATERIALS AND METHODS
MATERIALS AND METHODS. The concentration of allergen-specific IgE antibodies in the candidate for the PhRS IgE-Amb was determined by reverse allergosorbent test (REAST) using a commercial reagent kit manufactured in Russia. The identity of the candidate for the PhRS IgE-Amb was determined according to General Pharmacopoeia Monograph 1.7.2.0034.15 by direct ELISA. Tests of the candidate for the PhRS IgE-Amb for the quality attributes (Description, Water, Mass homogeneity, Solubility, and Tightness) were conducted in accordance with the requirements of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation (SP RF). Allergenic activity was assessed by competitive ELISA. Statistical analysis was performed using analysis of variance (ANOVA).
RESULTS
RESULTS. The candidate for the PhRS IgE-Amb was certified according to the approved certification program. The certified characteristic of the PhRS IgE-Amb, i.e., the concentration of specific IgE antibodies to common ragweed pollen allergen, was determined by the REAST method and found to be 27.02±4.6 IU/mL (class 4). The specificity of binding of the PhRS IgE-Amb to common ragweed pollen allergen was confirmed. The results of tests for additional quality attributes (Description, Water, Mass homogeneity, Solubility, Tightness) met the requirements of the SP RF. The feasibility of using the PhRS IgE-Amb for determining the concentration of IgE antibodies in enterprise reference sera by direct ELISA and for assessing common ragweed pollen allergen activity by competitive ELISA was demonstrated. The coefficients of variation between the known values and those determined using the RS were 4.7% for direct ELISA and 8.0% for competitive ELISA.
CONCLUSIONS
CONCLUSIONS. For the first time, a Russian pharmacopoeial reference standard of lyophilized IgE-containing serum to common ragweed pollen allergen has been certified with the established characteristic — the concentration of specific IgE antibodies to common ragweed pollen allergen determined by REAST. The PhRS IgE-Amb complies with the requirements of the SP RF, is recommended for inclusion in the State Register of Reference Standards, and enables the standardization of allergens and reference sera in the Russian Federation.
аллерген пыльцы амброзииаллергеныаллергенная активностьиммуноферментный анализреверсивный аллергосорбентный тестстандартный образецФСОIgEантителалиофилизированная сывороткадисперсионный анализаттестацияragweed pollen allergenallergensallergenic activityELISAreverse allergosorbent testreference standardPhRSIgEantibodylyophilized serumanalysis of variancecertificationРабота выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00061-26-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР № 124022200103-5)This study was conducted at the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products as part of the applied research funded under State Assignment No. 056-00061-26-00 (R&D state registration No. 124022200103-5)ВВЕДЕНИЕ
Одним из главных показателей качества препаратов аллергенов является оценка их специфической активности. У большинства российских препаратов аллергенов для оценки этого показателя применяются кожные пробы (прик-тест)1 [1][2]. Кожные пробы проводят на пациентах с аллергическими заболеваниями, что представляет морально-этическую проблему, поскольку введение аллергена может быть опасным для здоровья (возможны местные кожные реакции и, крайне редко, системные осложнения — крапивница, анафилактический шок) [3][4]. Отказ от испытаний на людях при оценке аллергенной активности является актуальной задачей. За последние годы предприняты значительные усилия по разработке альтернативных методов in vitro, позволяющих оценивать качество лекарственных препаратов без использования животных [5].
В настоящее время применяют разные методы иммуноанализа, основанные на ингибировании связывающей активности сывороточного иммуноглобулина E (IgE) человека, специфичного к исследуемому аллергену, включая конкурентный иммуноферментный анализ (кИФА или ингибиция ИФА) [6][7]. Специфическую сыворотку для этого метода получают из крови пациентов с подтвержденным аллергическим заболеванием. Международные требования к концентрации аллергенспецифических IgE-антител в сыворотке крови не разработаны2. Указание о том, что для исследований рекомендуется отбирать сыворотки с уровнем IgE-антител не менее 3-го класса (то есть сыворотки пациентов с выраженными клиническими проявлениями аллергического заболевания) имеется только в ОФС.1.7.2.0034.153.
Для обеспечения единства и требуемой точности измерений в методиках рекомендуется использовать стандартные образцы (СО) — международные, национальные, фармакопейные и др. [7][8]. В настоящее время существует 4 международные референс-сыворотки (National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC), содержащих следующие специфические IgE-антитела: к аллергену грибов Aspergillus fumigatus (78/545); к аллергену пыльцы березы (76/525); к аллергену пыльцы ежи сборной (77/503); к аллергенам клещей Dermatophagoides pteronyssinus (77/584)4. Референс-сыворотка, содержащая IgE-антитела к аллергену пыльцы амброзии, отсутствует. Фармацевтические компании, выпускающие препараты аллергенов, для оценки их активности используют внутренние референс-образцы аллергенспецифических сывороток в жидком виде [1].
Данные о разработке в Российской Федерации СО сывороток, содержащих специфические IgE-антитела к определенному аллергену, отсутствуют. Ранее авторами разработана технология получения лиофилизированных форм концентрированных аллергенспецифических сывороток, которые могут быть использованы в качестве фармакопейных стандартных образцов (ФСО) со сроком годности не менее 7 лет [9]. По этой технологии впервые произведен кандидат в ФСО лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии.
Цель работы — аттестация кандидата в ФСО лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии (ФСО IgE-Амб) и оценка возможности его применения для определения концентрации IgE и активности аллергена.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫМатериалы:Реактивы и реагенты
IgE-антитела козы против IgE человека, меченные пероксидазой хрена (goat anti-human IgE peroxidase labeled, KPL, США, кат. № 3074-1004); карбонат-бикарбонатный буфер (КББ), капсулы (Sigma-Aldrich, США, кат. № С30-41); фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) (Gibco, США, кат. № 14200-075); субстрат тетраметилбензидин, ТМБ (KPL, США, кат. № 5120-0038); полисорбат 20 (BioFroxx, Германия, кат. № 1247).
Оборудование
Анализатор Multiscan GO с программным обеспечением (Thermo Fisher Scientific, Финляндия); термошейкер Innova 4230 (New Brunswick Scientific Co., США); перемешивающее устройство (встряхиватель) Vortex Genie 2 G-560E (Binder & Hobein AG, США); устройство для промывки микропланшет Hydroflex (Tecan Group Ltd., Австрия); весы электронные Ohaus AR3130 (OHAUS Corporation, США); дозаторы переменных объемов (Sartorius biohit, Финляндия).
Методы
Реверсивный аллергосорбентный тест (РЕАСТ). РЕАСТ использовали для установления аттестуемой характеристики — количественного определения специфических IgE-антител к аллергену пыльцы амброзии — с помощью набора реагентов «АллергоИФА — специфические IgE» согласно инструкции по применению (рис. S1, опубликован на сайте журнала в Приложении 15).
РЕАСТ основан на сэндвич-методе ИФА, особенность которого состоит в использовании жидких биотинилированных аллергенов. На первой стадии после внесения сывороток и жидких биотинилированных аллергенов в лунки Fc-фрагменты всех молекул IgЕ в сыворотке связываются с Fab-фрагментами сорбированных мышиных моноклональных антител, биотинилированный аллерген — с Fab-фрагментами IgЕ-антител, специфичных к данному аллергену (при их наличии в сыворотке крови). В лунки с калибраторами (разведения общего IgE) вносили анти-IgE-антитела, меченные биотином. На второй стадии добавляли конъюгат — стрептавидин-пероксидазу. В качестве индикатора использовали ТМБ [10]. Результаты регистрировали с помощью анализатора Multiscan GO.
Концентрацию аллергенспецифических IgE в ФСО IgE-Амб определяли в международных единицах (МЕ), где 1 МЕ/мл соответствует 2,4 нг IgE на 1 л, или 1 килоединице на 1 л (kU/L) [10][11], и в классах (в виде интервалов концентрации IgE в МЕ/мл).
Для испытаний использовали 9 флаконов кандидата в ФСО IgE-Амб. Каждый флакон тестировали в 6 повторностях. Испытания проводили три оператора в разные дни.
Критерии приемлемости испытания
Метод ИФА. Показатель «Подлинность/Специфичность» определяли в соответствии с ОФС.1.7.2.0034.156. ФСО АЛЛ-Aмб, аллерген Dpte и аллергоид Pfes сорбировали в лунки планшета в концентрации 1000 PNU/мл (protein nitrogen unit — единицы белкового азота)7. Сыворотки, специфичные к аллергену пыльцы амброзии (ФСО IgE-Амб и СО-Э IgE-Амб — препарат сравнения), восстанавливали в 1,0 мл воды и готовили серию последовательных двукратных разведений, которые вносили в лунки с вышеуказанными аллергенами (рис. S2, Приложение 1). Перекрестная реактивность должна отсутствовать: значения ОП сывороток в лунках с другими (неодноименными) аллергенами должны быть ниже, чем в лунках с одноименным аллергеном.
Критерии приемлемости испытания
Кулонометрический метод (метод Фишера). Показатель «Вода» оценивали в соответствии с ОФС.1.2.3.0002.15 методом Фишера8.
Весовой метод. Показатель «Однородность дозирования» оценивали в соответствии с ОФС.1.4.2.00089.
Метод свечения. Показатель «Герметичность» определяли в соответствии с ОФС.1.4.2.002510.
Визуальный метод. Показатель «Растворимость» определяли в соответствии с ОФС.1.2.1.000511.
Метод конкурентного ИФА (кИФА). Показатель «Аллергенная/специфическая активность» оценивали методом кИФА (модификация АО «НПО «Микроген», Россия) [1] (рис. S3, Приложение 1). В лунках планшета сорбировали аллерген, далее вносили пробу — смесь аллергена и специфической сыворотки, содержащей IgE-антитела (рис. S1, Приложение 1). Определяемый аллерген в пробе конкурирует с сорбированным аллергеном за связывание с антителами, и активность аллергена обратно пропорциональна его концентрации в пробе12.
В качестве стандарта использовали СО предприятия (АО «НПО «Микроген», Россия) — жидкий аллерген пыльцы амброзии. СО предприятия сорбировали в концентрации 1000 PNU/мл. Ингибирующие растворы готовили в 6 последовательных разведениях СО предприятия и образца (СО-Э АЛЛ-Амб), к которым добавляли аллергенспецифические сыворотки: 1) контрольную сыворотку предприятия (КС IgE-Амб); 2) ФСО IgE-Амб. Специфическую активность выражали в единицах аллергенной активности — ЕАА/мл (100000 ЕАА соответствуют разведению, вызывающему кожную реакцию в виде папулы 8 мм у сенсибилизированных пациентов)13.
Критерии приемлемости испытания
Статистическая обработка данных. Значение аттестованной характеристики определяли как среднее арифметическое всех повторностей. Статистический анализ выполняли с использованием программ Multiscan Scanit RE, Microsoft Office Exсel, рассчитывая среднеарифметическое значение (M), стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV). Статистический анализ кривых проводили с использованием программы PLA 2.0 (дисперсионный анализ методом параллельных линий)14.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Все испытания кандидата в ФСО лиофилизированной аллергенспецифической сыворотки, содержащей IgE-антитела к аллергену пыльцы амброзии (ФСО IgE-Амб), проведены согласно утвержденной программе аттестации.
Аттестуемая характеристика ФСО IgE-Амб
Аттестуемой характеристикой являлась концентрация аллергенспецифических IgE-антител, выраженная в МЕ/мл и в классах (табл. 1)15. Перевод значений IgE в классы необходим для сравнения, поскольку уровень IgE-антител одной и той же сыворотки, установленный с помощью разных наборов реагентов, может отличаться [12], тогда как в классах эти значения совпадают.
Таблица 1. Концентрация аллергенспецифических IgE-антител в сыворотке (МЕ/мл) с указанием класса
Table 1. Concentration of allergen-specific IgE antibodies in serum (IU/mL) and class
Таблица составлена авторами по данным источников, представленных в сноске16 / The table was compiled by the authors based on data from the sources cited in footnote16
Примечание. * — кЕ/л — килоединица на 1 л (эквивалентна МЕ/мл).
Note. *, kU/L, kilo-units per liter (equivalent to IU/mL).
Аттестованное значение кандидата в ФСО IgE-Амб — концентрация специфических IgE-антител к аллергену пыльцы амброзии — была определена с помощью набора реагентов «АллергоИФА — специфические IgE» (метод РЕАСТ), который используется для оценки сенсибилизации пациентов к различным аллергенам [13]. Выбор данного набора обусловлен тем, что это первая российская разработка, у которой подтверждена высокая специфичность по сравнению с эталонной для определения IgE тест-системой ImmunoCAP, аллергочип (коэффициент корреляции — 0,86–0,99) [2][10][14]. Набор реагентов «АллергоИФА — специфические IgE» показал хорошую корреляцию с набором «Тест-система иммуноферментная для определения аллергенспецифических IgE-антител человека IgE-АТ-ИФТС»17 (метод ИФА), в котором результаты выражаются к классах18 (интервалы концентраций, связанных с тяжестью заболевания) [2].
Для установления значения аттестуемой характеристики (концентрации IgE-антител в МЕ/мл) рассчитывали М, SD, CV и класс (табл. 2).
Таблица 2. Концентрация IgE-антител к аллергену пыльцы амброзии, определенная разными операторами
Table 2. Concentration of IgE antibodies to the ragweed pollen allergen determined by different operators
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Аттестованное значение аллергенспецифических IgE-антител составило 27,02±4,60 МЕ/мл (4-й класс), что соответствовало рекомендованным значениям (не ниже 3-го класса)19. Полученные результаты соответствовали критериям приемлемости.
Оценка подлинности ФСО IgE-Амб
Определение подлинности проводили согласно программе аттестации по ОФС.1.7.2.0034.15 методом прямого ИФА20. Результаты испытаний представлены на рисунке 1.
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure was prepared by the authors using their own data
Рис. 1. Результаты оценки подлинности/специфичности исследуемых образцов. ФСО АЛЛ-Амб — кандидат в фармакопейный стандартный образец аллергена пыльцы амброзии полыннолистной (красная линия); СО-Э АЛЛ-Амб — стандартный образец аллергена пыльцы амброзии полыннолистной, лиофилизат, экспериментальная серия (синяя линия); Dpte — аллерген из клеща Dermatophagoides pteronyssinus (черная линия); Pfes — аллергоид овсяницы луговой (черная пунктирная линия).
Fig. 1. Results of authenticity/specificity assessment of the tested samples. PhRS ALL-Amb, candidate for pharmacopoeial reference standard of common ragweed pollen allergen (red line); RS-E ALL-Amb, reference standard of common ragweed pollen allergen, lyophilizate, experimental series (blue line); Dpte, allergen from the mite Dermatophagoides pteronyssinus (black line); Pfes, meadow fescue allergoid (black dashed line).
По результатам испытаний подтверждена специфичность связывания исследуемых СО (ФСО IgE-Амб и СО-Э IgE-Амб) с одноименным аллергеном — аллергеном пыльцы амброзии полыннолистной (ФСО АЛЛ-Амб). Перекрестные реакции с аллергенами других наименований (Dpte и Pfes) — отсутствовали. Полученные результаты соответствовали критериям приемлемости21. Вычисленная относительно ФСО концентрация IgE-антител в образце СО-Э IgE-Амб составила 16,12 МЕ/мл, что сопоставимо с известным значением, полученным методом РЕАСТ (15,08 МЕ/мл), коэффициент вариации между значениями составил 4,7%.
Дополнительные показатели качества ФСО IgE-Амб
В соответствии с программой аттестации были проведены испытания ФСО IgE-Амб по следующим дополнительным показателям: «Описание», «Вода», «Однородность массы», «Растворимость», «Герметичность». Необходимость проведения испытаний по этим показателям обусловлена требованиями ВОЗ к стандартным образцам и ОФС.1.4.1.003122. Все результаты испытаний соответствовали нормам, приведенным в таблице 3.
Таблица 3. Результаты испытаний по дополнительным показателям кандидата в фармакопейный стандартный образец лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии полыннолистной (ФСО IgE-Амб)
Table 3. Results of additional tests for the candidate pharmacopoeial reference standard of lyophilized IgE-containing serum to common ragweed pollen allergen (PhRS IgE-Amb)
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Показатель (метод)Parameter (method)
ТребованиеRequirement
РезультатResult
Описание (визуальный)Description (visual)
Лиофилизат должен быть в виде таблетки от светло-желтого до темно-желтого цвета. Восстановленный раствор: непрозрачная жидкость от светло-желтого до темно-желтого цвета, допустимо выпадение небольшого осадкаThe lyophilizate should be a light yellow to dark yellow tablet. Reconstituted solution: opaque liquid, light yellow to dark yellow, a small amount of precipitate is acceptable
Лиофилизат — таблетка светло-желтого цвета. Восстановленный раствор: непрозрачная жидкость желтого цветаLyophilizate is a light yellow tablet. Reconstituted solution: opaque yellow liquid
Подлинность (ИФА)Identity (ELISA)
Оптическая плотность для кандидата в ФСО IgE-Амб без разведения в лунках с аллергеном пыльцы амброзии полыннолистной должна быть выше 1,0Optical density for the candidate for the PhRS IgE-Amb without dilution in wells with common ragweed pollen allergen should be higher than 1.0
3,66
Однородность массы (весовой)Uniformity of mass (weight)
Отклонение массы содержимого 10 флаконов от средней массы не должно превышать ±10%. Не более 2 флаконов могут иметь массу содержимого, отличающуюся от средней массы более чем на ±10%, но не более чем на ±20%Deviation of the content mass of 10 vials from the average mass should not exceed ±10%. No more than 2 vials may have a content mass that differs from the average mass by more than ±10%, but not more than ±20%
Должно наблюдаться голубое свечениеA blue glow should be observed
Наблюдается голубое свечениеA blue glow is observed
Растворимость (визуальный)Solubility (visual)
Содержимое флакона растворяется в воде в течение 1 минVial contents dissolve in water within 1 min
<1 мин<1 min
Вода (метод Фишера)Water (Fischer's method)
Не более 3,0%Not more than 3.0%
0,57
Применение ФСО IgE-Амб для оценки аллергенной активности методом конкурентного ИФА
Для проведения исследования использовали два вида раствора для ингибиции: 1 — смесь аллергена и контрольной сыворотки (КС IgE-Амб), 2 — смесь аллергена и ФСО IgE-Амб. Для статистической обработки результатов использовали программу PLA 2.0 (табл. 4). Полученные результаты соответствовали критериям приемлемости и показали, что ФСО IgE-Амб может быть использован для оценки активности аллергенов методом кИФА.
Таблица 4. Активность стандартного образца аллергена пыльцы амброзии полыннолистной методом конкурентного ИФА
Table 4. Activity of the reference standard of common ragweed pollen allergen by competitive ELISA
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Примечание. КС IgE-Амб — контрольная аллергенспецифическая сыворотка крови человека, содержащая IgE-антитела к аллергену пыльцы амброзии; ФСО IgE-Амб — фармакопейный стандартный образец лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии полыннолистной; ЕАА — единицы аллергенной активности; СV — коэффициент вариации.
Note. CS IgE-Amb, control allergen-specific human serum containing IgE antibodies to ragweed pollen allergen; PhRS IgE-Amb, pharmacopoeial reference standard of lyophilized IgE-containing serum to common ragweed pollen allergen; UAA, units of allergenic activity; CV, coefficient of variation.
Таким образом, проведена аттестация первого российского ФСО IgE-содержащей сыворотки, международные аналоги которого отсутствуют. Аттестуемая характеристика — концентрация IgE-антител к аллергену пыльцы амброзии — установлена методом РЕАСТ с помощью российского набора реагентов, имеющего высокую корреляцию с аллергочипом ImmunoCAP, обладающим значительно более высокой стоимостью [2][10]. ФСО IgE-Амб имеет больший срок годности (7 лет) по сравнению с аналогом российского производства — жидкой референс-сывороткой (1 год)23. По истечении 7 лет планируется проводить ежегодный ретест ФСО для продления срока годности до 10 лет, как рекомендовано для международных СО24. ФСО IgE-Амб может быть использован для аттестации СО предприятий — как препаратов аллергенов, так и аллергенспецифических референс-сывороток.
ВЫВОДЫ
Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» опубликовано Приложение 1.
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Л.В. Невская — разработка программы аттестации, проведение экспериментальных исследований, анализ и статистическая обработка данных, оформление и интерпретация результатов; написание текста рукописи, формулировка выводов; Н.Э. Петрова, В.К. Капитанова — проведение экспериментальных исследований, интерпретация результатов, формулировка выводов, анализ данных литературы; Л.А. Гайдерова — обсуждение программы аттестации, анализ результатов исследования, редактирование выводов, утверждение окончательной версии статьи для публикации; О.В. Фадейкина — утверждение программы аттестации, анализ результатов исследования, редактирование текста рукописи.
Supplementary information. Supplementary material 1 is available on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.
Author contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. L.V. Nevskaya designed the certification program, conducted experimental studies, performed statistical data analysis, organized and interpreted the results, drafted the manuscript, and formulated the conclusions. N.E. Petrova, and V.K. Kapitanova conducted experimental studies, interpreted the results, formulated the conclusions, and analyzed the literature data. L.A. Gaiderova discussed the certification program, analyzed the study results, edited the conclusions, and approved the final version of the article for publication. O.V. Fadeikina approved the certification program, analyzed the study results, and edited the manuscript text.
1. ОФС.1.7.2.0040.18 Определение специфической (аллергенной) активности аллергенов и аллергоидов методом кожных проб. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.2. Guideline on allergen products: production and quality issues (EMEA/CHMP/BWP/304831/2007). EMEA; 2007.3. ОФС.1.7.2.0034.15 Определение подлинности аллергенов. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.4. https://nibsc.org/products/brm_product_catalogue/sub_category_listing.aspx?category=Diagnostics&subcategory=Immunoglobulins+and+immune+sera5. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-2-220-229-annex6. ОФС. 1.7.2.0034.15 Определение подлинности аллергенов Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.7. ОФС.1.7.2.0040.18 Определение специфической (аллергенной) активности аллергенов и аллергоидов методом кожных проб. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.8. ОФС.1.2.3.0002.15 Определение воды. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.9. ОФС.1.4.2.0008 Однородность дозирования. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023.10. ОФС.1.4.2.0025 Определение герметичности упаковки. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023.11. ОФС.1.2.1.0005 Растворимость. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023.12. Спирина ЛВ. Иммунохимические методы. ИФА — иммуноферментный анализ. https://en.ppt-online.org/20216713. ОФС.1.7.2.0040.18 Определение специфической (аллергенной) активности аллергенов и аллергоидов методом кожных проб. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.14. PLA 2.0. https://www.stegmanns.com15. https://helix.ru/kb/item/21-622 https://dermnetnz.org/topics/immunoglobulin-e-tests16. https://helix.ru/kb/item/21-622 https://dermnetnz.org/topics/immunoglobulin-e-tests17. Отчет по НИР ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, 2019–2023 гг. «Разработка перспективных направлений совершенствования экспертизы качества, эффективности и безопасности биологических лекарственных препаратов и стандартизации методов их оценки».18. Инструкция к набору реагентов «Тест-система иммуноферментная для определения аллергенспецифических IgE-антител человека IgE-АТ-ИФТС». АО «НПО «Микроген».19. ОФС.1.7.2.0034.15 Определение подлинности аллергенов. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.20. Там же.21. Симушкин СВ. Методические разработки по специальному курсу Дисперсионный анализ. Казань: Казанский государственный университет; 1998.ОФС.1.1.0013 Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023.22. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards, Annex 2, TRS No 932. WHO; 2026.ОФС.1.4.1.0031 Лиофилизаты. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023.23. Паспорт на набор реагентов «Тест-система иммуноферментная для определения аллергенспецифических IgE-антител IgE-АТ-ИФТС». АО «НПО «Микроген».24. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards, Annex 2, TRS No 932. WHO; 2026.
ReferencesСаканян ЕИ, Ясная МА, Вуль ВФ и др. Лекарственные препараты пыльцевых аллергенов: современные аспекты стандартизации. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2023; 23(3–1):367–78. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2023-23-3-1-367-378Sakanyan EI, Yasnaya MА, Vul VF, et al. Pollen allergen products: Current standardisation issues. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2023;23(3–1):367–78 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2023-23-3-1-367-378Невская ЛВ, Капитанова ВК, Петрова НЭ. Сравнительный анализ современных методов диагностики аллергических реакций немедленного типа. Иммунология. 2020;41(4):363–9. https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-4-363-369Nevskaya LV, Kapitanova VK, Petrova NE. Comparative analysis of modern methods for diagnostics of immediate allergic reactions. Immunologiya. 2020;41(4):363–9 (In Russ.). https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-4-363-369Гаджимагомедова ШС, Гебекова МБ, Маликова МД. Морально-этические проблемы проведения клинических испытаний и экспериментов на человеке. Образование и право. 2023;(10):182–6. EDN: XMPSLKGadzhimagomedova ShS, Gebekova MB, Malikova MD. Moral and ethical problems of conducting clinical trials and experiments on humans. Education and Law. 2023;(10):182–6 (In Russ.). EDN: XMPSLKБалаболкин ИИ, Мачарадзе ДШ. Кожные пробы: показания и противопоказания. Вопросы современной педиатрии. 2013;12(3):31–7. EDN: RASZGXBalabolkin II, Macharadze DSh. Skin tests: Indications and contraindications. Current Pediatrics. 2013;12(3):31–7 (In Russ.). EDN: RASZGXГайдерова ЛА, Алпатова НА, Головинская ОВ и др. Реализация концепции 3Rs при контроле качества биологических лекарственных препаратов: современное состояние и перспективы (обзор). Безопасность и риск фармакотерапии. 2025;13(2):229–40. https://doi.org/10.30895/2312-7821-2025-13-2-229-240Gayderova LA, Alpatova NА, Golovinskaya OV, et al. Implementation of the 3Rs concept in quality control of biologicals: Status and prospects (review). Safety and Risk of Pharmacotherapy. 2025;13(2):229–40 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2312-7821-2025-13-2-229-240Zimmer J, Vieths S, Kaul S. Standardization and regulation of allergen products in the European Union. Curr Allergy Asthma Rep. 2016;16(3):1621. https://doi.org/10.1007/s11882-016-0599-4Zimmer J, Vieths S, Kaul S. Standardization and regulation of allergen products in the European Union. Curr Allergy Asthma Rep. 2016;16(3):1621. https://doi.org/10.1007/s11882-016-0599-4Zimmer J, Bridgewater J, Ferreira F, et al. The history, present and future of allergen standardization in the United States and Europe. Front Immunol. 2021;12:725831. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.725831Zimmer J, Bridgewater J, Ferreira F, et al. The history, present and future of allergen standardization in the United States and Europe. Front Immunol. 2021;12:725831. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.725831Комаровская ЕИ, Фадейкина ОВ, Лыско КА и др. Аттестация фармакопейного стандартного образца для оценки специфической активности адсорбированного столбнячного анатоксина на морских свинках. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2025;25(2):182–92. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-2-182-192Komarovskaya EI, Fadeikina OV, Lysko KA, et al. Certification of a pharmacopoeial reference standard for potency testing of adsorbed tetanus toxoid in guinea pigs. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2025;25(2):182–92 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-2-182-192Невская ЛВ, Воропаев АА, Фадейкина ОВ и др. Способ получения лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащего аллергенспецифический иммуноглобулин Е (варианты). Патент Российской Федерации № 2802333; 2022. EDN: QGSUMANevskaya LV, Voropaev AA, Fadeikina OV, et al. Method of obtaining lyophilized form of serum reference sample containing allergen-specific immunoglobulin E (versions). Patent of the Russian Federation No. 2802333; 2022 (In Russ.). EDN: QGSUMAКочиш ЛТ, Мухортых ОЮ, Иванова НА, Кузьмина ГА. Сравнительная характеристика тест-системы «АллергоИФА — специфические IgE» ООО «Компания АлкорБио» и «ImmuCap» фирмы Phadia. Справочник заведующего КДЛ. 2012;(5):37–43. EDN: QBPCNRKochish LT, Mukhortykh OYu, Ivanova NA, Kuzmina GA. Comparative characteristics of the test system “AllergoIFA — distinctive IgE” of AlkorBio Company LLC and “ImmuCap” of Phadia. Handbook of the Head of the Clinical Diagnostic Laboratory. 2012;(5):37–43 (In Russ.). EDN: QBPCNRМокроносова МА Диагностическое значение уровня общего IgE, основного маркера аллергической патологии. Лабораторная служба. 2015;4(3):10–4. https://doi.org/10.17116/labs20154310-14Mokronosova MA. Diagnostic value of serum total IgE the primary marker of allergic diseases. Laboratory Service. 2015;4(3):10–4 (In Russ.). https://doi.org/10.17116/labs20154310-14Filep S, Tsay A, Valies L, et al. A multi-allergen standard for calibration of immunoassay: CREATE principles applied to eight purifiled allergens. Allergy. 2012;67(2):235–41. https://doi.org/10.1111/j.1398-9995.2011.02750.xFilep S, Tsay A, Valies L, et al. A multi-allergen standard for calibration of immunoassay: CREATE principles applied to eight purifiled allergens. Allergy. 2012;67(2):235–41. https://doi.org/10.1111/j.1398-9995.2011.02750.xКозлова ЯИ, Васильев НЮ, Фролова ЕВ и др. Спектр сенсибилизации к аэроаллергенам как один из факторов риска неконтролируемого течения тяжелой бронхиальной астмы. Российский аллергологический журнал. 2023;20(3):275–86. https://doi.org/10.36691/RJA15043Kozlova YaI, Vasiliev NYu, Frolova EV, et al. Spectrum of sensitization to aeroallergens as one of the risk factors for uncontrolled severe asthma. Russian Journal of Allergy. 2023;20(3):275–86 (In Russ.). https://doi.org/10.36691/RJA15043Литовкина АО, Бязрова МГ, Смольников ЕИ и др. Особенности молекулярного профиля сенсибилизации у пациентов с аллергией на пыльцу березы и перекрестной пищевой аллергией к PR-10 белкам. Российский аллергологический журнал. 2023;20(4):464–75. https://doi.org/10.36691/RJA16901Litovkina AO, Byazrova MG, Smolnikov EV, et al. Characteristics of the molecular sensitization profiles in patients with birch pollen allergy and cross-reactive food allergy to PR-10 proteins. Russian Journal of Allergy. 2023;20(4):464–75 (In Russ.). https://doi.org/10.36691/RJA16901
The authors declare that there are no conflicts of interest present.