Одними из самых распространенных высококонтагиозных вирусных заболеваний являются корь, краснуха и эпидемический паротит1. Многолетний опыт эпидемиологического надзора за корью, краснухой и паротитом подтверждает высокую эффективность применяемой тактики вакцинопрофилактики данных инфекций2. Известно, что в геноме РНК-содержащих вирусов, в том числе вирусов кори, краснухи и паротита, часто возникают и накапливаются спонтанные мутации [1]. Процесс производства вакцин также нередко сопровождается возникновением и накоплением мутаций в вакцинных штаммах, некоторые из которых способны привести к изменениям антигенных свойств вируса. Помимо вакцинных штаммов кори [2], краснухи [3] и паротита [4], это установлено и для других РНК-содержащих вирусов, против которых разработаны вакцины, например для вакцинного штамма 17-D вируса желтой лихорадки [5], что, как следствие, может оказать отрицательное влияние на защитные функции препарата, а также привести к частичному восстановлению вирулентности вируса.

В настоящее время одним из требований к производству вакцинных препаратов, содержащих живые вакцинные штаммы вирусов, является контроль генетической стабильности производственных штаммов, рекомендованный руководством ICH3 и Государственной фармакопеей Российской Федерации (ГФ РФ) XIV изд.4 Для РНК-вирусов, в том числе для вирусов эпидемического паротита, кори и краснухи, характерно накопление мутаций при репликации, в результате которого препарат вируса представляет собой гетерогенную смесь молекул геномной РНК с отличающимися нуклеотидными последовательностями (квазивиды) [1][6]. В зависимости от условий рост вируса как in vitro, так и in vivo приводит к отбору различных субпопуляций, что может влиять на свойства вируса, включая вирулентность. Для некоторых вакцинных штаммов вируса эпидемического паротита (в частности, Urabe AM9) было показано возникновение вакцино-ассоциированных осложнений в результате частичного восстановления вирулентности, однако клинически данные случаи протекали легко и не приводили к неблагоприятным исходам [7][8]. Поскольку вакцинные штаммы подвержены генетической изменчивости, которая может повлиять на их профиль безопасности, выяснение молекулярного механизма ослабления живых вакцин и путей их реверсии к вирулентности может помочь в разработке методов молекулярного контроля качества, что особенно важно в случае живой вакцины против эпидемического паротита [9].

Хотя в ряде исследований для вакцинных штаммов вирусов кори и краснухи была продемонстрирована высокая степень генетической стабильности в процессе длительного пассирования, в их геномах могут накапливаться минорные мутации, которые при дальнейшем накоплении могут привести к изменению консенсусных аминокислотных последовательностей вакцинных штаммов, что делает актуальной задачу периодического контроля стабильности вакцинных штаммов [4][10–13]. В настоящее время стандартной практикой для решения этой задачи стало применение методов высокопроизводительного секвенирования (методов секвенирования нового поколения, далее NGS-секвенирование), которые обладают высокой чувствительностью и дают возможность определить даже минорные мутации, возникшие в вирусной популяции [11][12][14–16].

Высокопроизводительное полногеномное секвенирование позволяет не только осуществлять эпидемиологический надзор за социально значимыми инфекциями, но и проводить контроль качества при производстве вакцин с целью долгосрочного мониторинга стабильности, поскольку он обеспечивает высокую точность и раннее выявление новых вариантов, что подтверждают ранее проведенные исследования для вирусов кори и паротита [2][17]. В отношении вакцинных штаммов краснухи отсутствуют исследования, в которых проводилось NGS-секвенирование данных штаммов, в том числе RA27/3 (исследования молекулярно-генетической характеристики данного штамма ограничены секвенированием по Сэнгеру). В то же время для некоторых вакцинных штаммов кори и паротита имеются данные об NGS-секвенировании и секвенировании по Сэнгеру [18][19].

Для отечественных вакцинных штаммов кори (Ленинград-16) и паротита (Ленинград-3), которые входят в состав живых аттенуированных вакцин, применяемых на территории России, в настоящее время также доступны в GenBank только полные геномы, полученные методом капиллярного секвенирования по Сэнгеру. Таким образом, генетическая характеристика с оценкой генетической стабильности полногеномных последовательностей данных штаммов методами высокопроизводительного секвенирования, имеет важное практическое значение.

Цель работы — анализ нуклеотидных последовательностей геномов посевных и производственных штаммов вирусов кори (Ленинград-16), краснухи (RA-27/3) и паротита (Ленинград-3),в сравнении с референсными нуклеотидными последовательностями геномов вакцинных штаммов, ранее депонированных в базу данных GenBank.

Исследование выполнялось на базе лаборатории молекулярной вирусологии ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России в январе 2025 г.

Материалы

Исследуемые образцы. В работе использованы производственные штаммы трех культуральных живых вакцин против кори, краснухи и паротита. Производственные штаммы предоставлены АО «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген». В таблице 1 представлена характеристика образцов, используемых в работе.

Методы

Выделение РНК исследованных образцов проводили с применением набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя, от каждого образца на выделение было взято 140 мкл. Предварительно лиофилизаты образцов CS1154, CS1159 и CS1160 были разведены в 1 мл питательной среды 199. Лиофилизат образца CS1157 был разведен в 1 мл питательной среды F-12/MEM.

Получение кДНК осуществляли методом обратной транскрипции с использованием M-MLV-ревертазы (набор Magnus Reverse transcriptase, «Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. Амплификацию продуктов обратной транскрипции для последующего секвенирования осуществляли с использованием набора «БиоМастер LR HS-ПЦР (2X)» (ООО «Биолабмикс», Россия) согласно инструкции производителя. Накопление кДНК для последующего секвенирования проводили с использованием методов SMART и SISPA, демонстрирующих высокую специфичность при тестировании как на клинических образцах, так и на изолятах возбудителей [20][21]. Для образца кори CS1156 дополнительно проводилась независимая амплификация полного генома с применением специфичной праймерной панели для вируса кори для сравнения полученных консенсусных последовательностей и подтверждения воспроизводимости данных NGS-секвенирования.

После амплификации продуктов обратной транскрипции и их очистки для последующего секвенирования проводили оценку концентрации очищенных продуктов перед приготовлением библиотек. Объем каждого образца ДНК на вход в реакцию подбирали таким образом, чтобы концентрация ДНК всех образцов находилась в диапазоне от 50 до 80 нг/образец. Концентрации полученных ДНК-библиотек составили от 70,0 до 87,8 нг/мкл.

Подготовка библиотек и NGS-секвенирование. Подготовка ДНК-библиотек проведена с использованием набора реагентов DNBSEQ VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI (Vazyme, КНР). Протокол включает предварительную очистку ДНК, ферментативную фрагментацию, лигирование адаптеров и амплификацию. Предварительную очистку продуктов амплификации методом SMART и SISPA проводили на магнитных частицах. Качество полученных ДНК-библиотек оценивали с использованием флуориметра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США) и набора Equalbit dsDNA HS Assay Kit (Vazyme, КНР) для анализа двухцепочечной ДНК.

Далее ДНК-библиотеки пулировали по массе в равном соотношении. Готовые пулы проходили этап циркуляризации с использованием набора MGIEasy Circularization Kit (MGI, КНР). Приготовление ДНК-наношариков из циркуляризованных библиотек и последующее секвенирование было выполнено с использованием набора реагентов для одноконцевого прочтения и проточной ячейки DNBSEQ-G400RS High-throughput Sequencing Set FCL SE100 (MGI, КНР) на секвенаторе MGI DNBSEQ G-400.

Для приготовления ДНК-библиотеки для NGS-секвенирования на платформе Illumina использовали набор реагентов Illumina DNA Prep и набор индексирующих олигонуклеотидов Illumina DNA/RNA UD Indexes Set B, Tagmentation. Секвенирование проводили на приборе Illumina NextSeq 2000 с использованием набора реагентов NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Cartridge (100 Cycles).

Сборка и обработка данных секвенирования. Для оценки качества первичных данных секвенирования использовали программное обеспечение FastQC v.0.12.1 (лицензия GPL v3)5. Для фильтрации низкокачественных данных и адаптерных последовательностей применяли программное обеспечение FastP v.0.23.4 (лицензия MIT)6 [22]. Прочтения были картированы на эталонные последовательности вакцинных штаммов с использованием BWA-MEM2 v.2.2.1 (лицензия MIT) [23]. Для получения черновых консенсусных последовательностей по правилу наибольшей представленности использовали утилиту iVar v.1.4.3 (лицензия GPL v3)7 [24]. Глубина покрытия рассчитывалась с использованием samtools depth, с последующим построением графиков распределения покрытия с помощью библиотеки python matplotlib. Визуализацию графиков покрытий проводили с помощью инструмента VizCoV8.

Биоинформатический анализ полученных последовательностей. Проведено сравнение консенсусных последовательностей исследованных образцов с референсными последовательностями вакцинных штаммов из базы данных GenBank для кори (Ленинград-16, GenBank Acc. No. JF727649.1), краснухи (RA 27/3, GenBank Acc. No. JF727653.2) и паротита (Ленинград-3, GenBank Acc. No. JF727651.1). Данные референсные последовательности были ранее депонированы в GenBank компанией АО «НПО «Микроген» [25][26].

Дополнительно проводился поиск однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) с использованием lofreq (лицензия MIT)9 [27]. Выявленные полиморфизмы с аллельной частотой более 50% далее применялись к черновой консенсусной последовательности с помощью bcftools consensus (лицензия GPL v3)10 [28] для получения финальной сборки в формате fasta. Выявленные полиморфизмы с частотой встречаемости 10–50% в позициях с глубиной покрытия 20× и более использовались для анализа гетерогенности вирусной популяции в исследованных образцах.

В исследовании было проведено секвенирование 9 образцов производственных штаммов и посевных вирусов для культуральных живых вакцин коревой и паротитной, а также вакцины против краснухи (табл. 1). Качество полученных сырых данных секвенирования для всех образцов было оценено как удовлетворительное, прочтения были картированы на эталонные последовательности вакцинных штаммов. В качестве целевой минимальной глубины покрытия было принято значение 20× [29][30]. Позиции с глубиной прочтения ниже 20× рассматривались как неопределенные. Для всех образцов были получены консенсусные последовательности геномов. Данные по глубине покрытия геномов секвенированных образцов приведены в таблице 2. На рисунках 1–3 представлены графики покрытий.

Для всех образцов, кроме образцов вакцины против краснухи и производственного штамма коревой вакцины, удалось достичь медианного покрытия более 10000×, что соответствует ультраглубокому секвенированию [31]. Глубокое и ультраглубокое секвенирование позволяет проводить не только сравнение консенсусных последовательностей, но также и анализ минорных вариантов вируса в исследуемых образцах [32].

Для всех исследованных последовательностей не было выявлено нуклеотидных и аминокислотных различий между консенсусными последовательностями геномов главного и рабочего посевных материалов, что свидетельствует о генетической стабильности штаммов на данном этапе производства.

На рисунке 4 представлено распределение выявленных замен в геномах исследованных образцов главного посевного материала (ГПМ) и рабочего посевного материала (РПМ) вирусов кори, краснухи и паротита. Интересно отметить, что существуют как более консервативные белок-кодирующие участки геномов, в которых не были выявлены мутации и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), так и наиболее вариабельные участки генома. Для исследованных образцов вируса кори (CS1154–CS1156) продемонстрировано, что наиболее консервативными участками генома оказались участки, кодирующие N-белок и H-белок, а для исследованных образцов вируса паротита (CS1159–CS1162) — участки, кодирующие P-белок и M-белок. При этом для исследованных образцов вирусов краснухи (CS1157–CS1158) не выявлено генов, в которых не были бы выявлены нуклеотидные замены.

Сравнение консенсусных последовательностей из идентичных образцов вируса кори, амплифицированных разными методами. С целью подтверждения выявленных замен было проведено сравнение консенсусных последовательностей генома вируса кори из образца CS1156, который был амплифицирован методом универсальной амплификации вирусных геномов SISPA и с использованием специфичной праймерной панели для вируса кори. Не выявлены отличия между консенсусными последовательностями исследованных образцов, амплифицированных разными методами (табл. 3).

Сравнение консенсусных последовательностей с референсными последовательностями, депонированными ранее в GenBank. В таблице 4 приведены нуклеотидные замены в белок-кодирующих участках генома вирусов кори, краснухи и паротита в исследованных образцах относительно референсных последовательностей вакцинных штаммов АО «НПО «Микроген» из базы данных GenBank. Аннотирование образцов проводилось на референсные последовательности кори (вакцинный штамм Ленинград-16, GenBank Acc. No., JF727649.1), краснухи (вакцинный штамм RA 27/3, GenBank, Acc. No. JF727653.2) и паротита (вакцинный штамм Ленинград-3, GenBank, Acc. No. JF727651.1).

Для исследованных образцов вируса кори (CS1154–CS1156) при сравнении с референсной последовательностью не выявлено аминокислотных замен, оказывающих влияние на антигенные свойства и иммуногенность, в том числе в Н-белке [33]. Также было выявлено 9 нуклеотидных замен в межгенных участках генома.

Из-за высокого содержания GC% в составе генома вируса краснухи, обусловленного природой вируса, не удалось достигнуть достаточной 20× глубины покрытия в некоторых областях генома, что не позволило достоверно определить нуклеотидные полиморфизмы в позициях генома штаммов вируса краснухи 2018–2349, 2724–3003, 3799–3889, 6607–6709. Однако по данным литературы установлено, что такие области кодируют NS-белок и часть белка C и не затрагивают участки, кодирующие поверхностные гликопротеины вируса краснухи, определяющие его антигенные свойства [34][35]. Анализ исследованных образцов вируса краснухи показал наличие миссенс-мутации C140W в аминокислотной последовательности NS-белка, не влияющей на антигенные свойства вакцинного вируса. Мутаций в межгенных участках генома не выявлено.

Анализ исследованных образцов вируса паротита (CS1159–CS1162) в сравнении с референсной последовательностью показал наличие миссенс-мутации в белке F (T239I), однако данная замена находится вне сайтов гликозилирования и не относится к нейтрализующим эпитопам [36]. В настоящее время отсутствуют данные литературы, свидетельствующие о возможном влиянии такой замены на антигенные свойства штаммов вируса паротита и их иммуногенность. Помимо указанной замены было выявлено 3 нуклеотидные замены в некодирующих областях генома.

Анализ минорных полиморфизмов в вирусной популяции в исследованных образцах. Проведен анализ распространения SNP внутри вирусной популяции в исследованных образцах. Аннотирование образцов проводилось на те же референсные последовательности вирусов кори, краснухи и паротита, которые использовались для выявления нуклеотидных замен в белок-кодирующих участках генома. Выявлен ряд минорных вариантов, которые при дальнейшем накоплении могут привести к изменению консенсусных аминокислотных последовательностей белков вакцинных штаммов (табл. S1–S3, онлайн-приложение 1 опубликовано на сайте журнала11).

В результате анализа полиморфизмов внутри вирусной популяции в исследованных образцах вируса кори (CS1154–CS1156) был выявлен полиморфизм в белке F, приводящий к аминокислотной замене S456P (доля вирусных геномов с такой заменой в образцах составляла 30,0–40,9%; данные приведены в таблице S1, онлайн-приложение 1), однако для замены S456P отсутствуют данные литературы о ее возможном влиянии на иммуногенность вакцинного штамма [37][38]. Важно подчеркнуть, что для исследованных образцов вируса кори не выявлено наличие полиморфизмов в белке Н, который является главным антигеном вируса кори [39]. Стоит отметить, что в участках, кодирующих P-белок и L-белок, были выявлены замены в геномах всех исследованных образцов, что также согласуется с данными литературы о том, что распределение мутаций в геноме вируса кори происходит не случайным образом, а имеет определенную закономерность [2].

Для исследованных образцов вируса краснухи (CS1157–CS1158) были выявлены полиморфизмы в капсидном белке (С-белок) и в поверхностном гликопротеине Е2, встречающиеся в вирусной популяции с частотой до 30% (табл. S2, онлайн-приложение 1). Хотя имеются данные о выявлении нейтрализующих антител как к гликопротеинам Е1 и Е2, так и к С-белку вируса краснухи [40], анализ данных литературы показал отсутствие информации о влиянии аминокислотных замен в С-белке на иммуногенность вакцинного штамма [41]. Для аминокислотных замен T413I и G458V в белке Е2 также отсутствуют данные литературы об их влиянии на иммуногенность [35].

Для исследованных образцов вируса паротита (CS1159–CS1162) были выявлены полиморфизмы в гемагглютинин-нейраминидазе (белок HN) и белке слияния (белок F), которые играют важную роль в формировании иммунного ответа (табл. S3, онлайн-приложение 1). Замены N348T и R373P в белке HN, к которым приводят полиморфизмы, находятся вне известных потенциальных сайтов гликозилирования и участков, изменения в которых могли бы оказывать влияние на иммуногенность вакцинных штаммов [42]. Для аминокислотных замен в белке F (I163T, L250V и I394R), возникающих в результате имеющихся полиморфизмов, отсутствуют данные литературы о влиянии этих замен на иммуногенность вакцинных штаммов [42]. Остальные структурные белки (NP, P, M, SH и L) вируса паротита не играют важной роли в формировании иммунного ответа, в связи с чем анализ выявленных в них полиморфизмов не проводился.

Следует отметить, что для образцов РПМ кори (CS1155 и CS1156) и паротита (CS1160–CS1162) с одинаковой пассажной историей наблюдались некоторые отличия в наборе однонуклеотидных полиморфизмов, вероятно, возникшие при пассировании ГПМ для получения РПМ в разные годы с использованием различного сырья (разные партии питательных сред, разные серии клеточных линий и др.), не приводящие к изменениям в консенсусных последовательностях.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещено онлайн-приложение 1 (таблицы S1–S3).

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-750-annex

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Наибольший вклад распределен следующим образом: А.И. Желтухина — написание текста рукописи, анализ данных; А.Б. Комиссаров — редактирование текста рукописи, руководство исследованием, анализ данных; А.В. Фадеев — применение метода SMART для проведения NGS секвенирования вакцинных штаммов, анализ минорных вариантов; Н.Д. Ёлшин — анализ сырых данных секвенирования, сборка вирусных геномов; М.М. Писарева — редактирование текста рукописи, анализ результатов; В.А. Едер — редактирование текста рукописи, работа с источниками литературы; М. Коржанова — подготовка библиотек для секвенирования; А.Д. Ксенафонтов — проведение пробоподготовки образцов; А.А. Передерий — анализ данных, визуализация полученных результатов, написание скриптов на языке программирования R; О.В. Охлопкова — редактирование текста рукописи, методологическое руководство секвенированием вирусов кори; Л.А. Саушкина — подготовка производственных штаммов для исследования; Е.В. Шведова — концепция исследования, участие в формулировке выводов, редактирование текста рукописи; Е.А. Гришина — утверждение окончательной версии статьи для публикации; Д.А. Лиознов — общее руководство проектом, редактирование рукописи, участие в формулировке выводов, утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Additional information. Supplement 1 (Table S1–S3) is published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-750-annex

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. A.I. Zheltukhina analyzed the data and drafted the manuscript. A.B. Komissarov edited the test of the manuscript, supervised the laboratory part of the project, and participated in data analysis. A.V. Fadeev implemented SMART technology for NGS sequencing of vaccine strains, minor variants analysis. N.D. Yolshin analyzed raw sequencing data, performed genome assembly. M.M. Pisareva edited the text of the manuscript and participated in analysis. V.A. Eder edited the text of the manuscript and worked with literature sources. M. Korzhanova conducted NGS library preparation. A.D. Ksenafontov did sample processing. A.A. Perederiy participated in data analysis, data visualization and coding in R. O.V. Ohlopkova edited the text of the manuscript and supervised the measles sequencing. L.A. Saushkina prepared production strains for research. E.V. Shvedova conceptualised the study, participated in formulating the conclusions, and edited the text of the manuscript. E.A. Grishina approved the final version of the manuscript for publication. D.A. Lioznov supervised the project, participated in formulating the conclusions, edited the text and approved the final version of the manuscript for publication.

1. Measles, mumps, rubella (MMR) vaccine safety. https://www.cdc.gov/vaccine-safety/vaccines/mmr.html2. МУ 3.1.2.1177–02 Эпидемиологический надзор за корью, краснухой и эпидемическим паротитом. М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России; 2003.3. ICH Q5D Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological/biological products. EMA; 1998.4. ФС.3.3.1.0024.15 Вакцина против краснухи культуральная живая, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. 2018.5. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/6. https://github.com/OpenGene/fastp7. https://github.com/andersen-lab/ivar8. https://github.com/LMV-NIC-St-Petersburg/VizCoV9. https://github.com/CSB5/lofreq10. https://github.com/samtools/bcftools11. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-750-annex