Одним из направлений совершенствования иммуноаналитических методов является разработка реагентов для селективного определения антител различных классов с использованием антиизотипических моноклональных или поликлональных антител, получаемых из гипериммунных сывороток крови животных или гибридомных клеточных линий [1]. Получение таких антител — трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому возникает потребность в применении альтернативных реагентов с аналогичными функциями и более высокой стабильностью при меньших производственных затратах.

За последние два десятилетия внимание исследователей привлекают иммуноглобулин-связывающие белки патогенных микроорганизмов, такие как белки A, M и L [2], которые обладают природной способностью специфично связываться с определенными участками антител различных классов. Белок A, выделенный из Staphylococcus aureus, взаимодействует с Fc-фрагментом иммуноглобулина G (IgG) [3]; белок M — с Fc-фрагментом IgM; белок L — с κ-цепями Fab-фрагмента. Основные преимущества данных белков заключаются в универсальности, высокой специфичности и простоте получения рекомбинантных вариантов в непатогенных организмах-продуцентах.

Наибольшее распространение в иммуноаналитических методах исследования, таких как вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ [4–6], получил белок A и его рекомбинантные варианты, в частности Z‑домен, созданный на основе B-домена белка A S. aureus [7]. Z‑домен состоит из 58 аминокислотных остатков, образует три антипараллельные α‑спирали [8] и обладает аффинностью к Fc-участкам IgG [9]. Z‑домен устойчив к протеазам и может быть экспрессирован в клетках Escherichia coli. Используя методы генной инженерии, можно создавать функциональные гибридные белки с Z‑доменом [10][11].

Применение Z‑домена в качестве универсального реагента в иммуноанализе [12][13] подразумевает его конъюгацию с ферментными метками, такими как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена (HRP). Данные ферменты усиливают аналитический сигнал при использовании соответствующих субстратов. Однако ферментные метки имеют следующие недостатки: необходимость применения специфических субстратов, что усложняет и удорожает анализ; потеря активности при неправильном хранении; снижение эффективности связывания и чувствительности анализа из-за крупных размеров ферментов. Также исследователи часто обращаются к альтернативным системам обнаружения, основанным на флуоресцентных метках [14]. Использование химических флуорофоров позволяет напрямую детектировать флуоресцентный сигнал меченого белка без применения субстратов; кроме того, они стабильны и пригодны для мультиплексных форматов анализа. Тем не менее традиционные методы химической конъюгации таких меток имеют недостатки вследствие того, что требуются дополнительные реагенты и большое количество белка, а также существует риск нарушения функций белка из-за неспецифического присоединения меток [15].

Одним из возможных путей устранения указанных недостатков является создание рекомбинантных гибридных белков для иммуноанализа [16]. Гибридные белки могут объединять несколько функциональных доменов при сохранении их свойств [17]. Особый интерес представляют генетические конструкции, кодирующие гибридные белки, содержащие естественные флуорофоры, например GFP-подобные белки [18]. Комбинирование естественных флуорофоров в качестве меток с белком-носителем без потери его функциональности делает такие конструкции перспективными для биомедицинских исследований и иммуноанализа [19]. В качестве еще одного преимущества стоит отметить стабильность флуоресцентного сигнала. Это позволяет проводить иммунофлуоресцентный анализ с получением воспроизводимых результатов. Разнообразие флуоресцентных белков дает возможность создавать мультиплексные системы [20]. Несмотря на потенциальные преимущества Z‑домена для создания рекомбинантных флуоресцентных конструкций, аспекты разработки стабильных диагностических тест-систем на их основе для обнаружения сывороточных антител остаются малоизученными.

В литературе недостаточно данных о применении подобных рекомбинантных белков для количественного определения сывороточных IgG. Так, были найдены два исследования, посвященные использованию Z‑домена, меченного флуоресцентными белками, преимущественно в микроскопии [21][22]; данные о разработках мультиплексных систем с использованием меченного флуоресцентными белками Z‑домена не обнаружены.

В свою очередь, использование различных флуоресцентных белков с уникальными спектральными характеристиками в качестве меток дает возможность одновременно применять флуоресцентно-меченный Z‑домен в одной пробе с другими мечеными конъюгатами. Создание универсального в применении флуоресцентного реагента для обнаружения целевых IgG в сыворотке крови значительно упростит и удешевит иммуноанализ, позволит повысить его воспроизводимость и откроет возможности для разработки прототипов тест-систем.

Цель работы — получение гибридных белков на основе Z‑домена белка A для создания универсальных флуоресцентных реагентов для обнаружения IgG в сыворотке крови.

Гипериммунные сыворотки крови кроликов, которых иммунизировали отдельными конъюгатами полициклических ароматических углеводородов с бычьим сывороточным альбумином (ПАУ-БСА), получены ранее в нашей лаборатории в соответствии с протоколом, описанным в работе [23]. Сыворотки, содержащие поликлональные антитела к конъюгатам ПАУ-БСА, хранили при 4 °C с добавлением натрия азида до финальной концентрации 0,02%. В экспериментах использовали образец сыворотки крови кролика, иммунизированного конъюгатом бензо[а]пирена с БСА (БП-БСА) [24].

Гены, кодирующие mHoneydew и CyOFP1, были амплифицированы методом ПЦР с использованием ДНК-полимеразы PfuSe (НПО «СибЭнзим», Россия). В качестве матриц использовали коммерчески доступные плазмидные ДНК pNCS-mHoneydew и pKK-TEV-CyOFP1 (Addgene, США).

Для амплификации генов mHoneydew (696 п.н.) и CyOFP1 (702 п.н.), кодирующих белки с молекулярными массами 26,2 и 26,3 кДа соответственно, использовали праймеры F-mHondew g-s и R-mHondw6his (табл. 1). ПЦР-продукты mHoneydew и CyOFP1 обрабатывали эндонуклеазами BamHI и HindIII (НПО «СибЭнзим») в соответствии с протоколом производителя. Ген Z (171 п.н.), кодирующий Z‑домен белка А массой 6,5 кДа, амплифицировали с использованием праймеров F-Za и R-Za (табл. 1). В качестве матрицы использовали плазмиду pEZZ18 (Amersham, США). ПЦР-продукт гена Z обрабатывали эндонуклеазами Bsp19I и BamHI.

Плазмиду pCCO линеаризовали рестриктазами Bsp19I и HindIII. Продукты рестрикции — гены Z, mHoneydew и CyOFP1 — лигировали с вектором pCCO в присутствии Т4-лигазы (НПО «СибЭнзим») в соотношениях 1:1,5:1,5 для pCCO:Z:mHoneydew и 1:1,5:1,5 — pCCO:Z:CyOFP1. Полученные плазмидные конструкции pCCO-Z‑mHoneydew и pCCO-Z‑CyOFP1 проверяли ПЦР (праймеры CBD-F и R-mHondw6his). Дополнительно проводили секвенирование с использованием набора BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, США) и праймеров CBD-F и R-T0term (табл. 1).

Трансформацию плазмидных конструкций в E. coli штамм M15 осуществляли методом электропорации (Gene Pulser Xcell, Bio-Rad) при следующих условиях: кювета с зазором между электродами — 0,1 см; напряжение — 1800 В; емкость — 25 мкФ; сопротивление — 200 Ом; время продолжительности импульса — от 5 до 5,2 мс.

Бактериальные штаммы E. coli M15, экспрессирующие Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1, высевали на агаризованную среду LB, содержащую 150 и 50 мкг/мл ампициллина и канамицина соответственно, и культивировали в течение 16 ч при 37 °C. Отобранными колониями инокулировали 5 мл бульона LB с добавлением тех же антибиотиков и выращивали в течение 16 ч при 37 °C и перемешивании при скорости 125 об/мин. Суспензионную культуру переносили в 1,5 л среды LB, содержащую антибиотики, инкубировали при 37 °C и скорости 125 об/мин до достижения значения оптической плотности суспензии 0,5 при длине волны 600 нм. Экспрессию белков Z‑mHoneydew и Z‑СyOFP1 индуцировали добавлением изопропил β-D-тиогалактозида (ООО «Компания Хеликон», Россия) до конечной концентрации 1 мМ. После индукции культивирование продолжали в тех же условиях в течение 16 ч.

Клеточную биомассу собирали центрифугированием при 2000 g в течение 20 мин при 4 °C и промывали охлажденным фосфатно-солевым буферным раствором, ФСБР (pH 7,5). Осадок ресуспендировали в 10 мл лизирующего буферного раствора, содержащего 30 мM Na2HPO4 (pH 8,0), 300 мM NaCl, 20 мM имидазола, и разрушали ультразвуком (Sonics Vibracell, США) на льду. Растворимую фракцию выделяли путем центрифугирования при 14000 об/мин (ротор 45 Ti, центрифуга Optima L-90K, Beckman Coulter, США) в течение 20 мин при 4 °C. Супернатант наносили на колонку, содержащую 2 мл Ni²⁺-NTA агарозы (Serva, США), предварительно уравновешенную лизирующим буферным раствором. Смолу промывали 10 мл буферного раствора, содержащего 50 мM Na2HPO4 (pH 6,0), 300 мM NaCl, 40 мM имидазол и 10% глицерин. Белки Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 элюировали буферным раствором, содержащим 50 мM Na2HPO4 (pH 6,0), 300 мM NaCl, 150 мM имидазола и 10% глицерин. Полученные фракции диализовали против ФСБР и анализировали методом электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ)1.

Количественное определение белка в очищенных препаратах проводили с использованием набора Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, США).

Флуоресцентные свойства гибридных белков исследовали с использованием мультимодального микропланшетного ридера ClarioStar Plus (BMG Labtech, Германия). Рабочие растворы белков готовили путем 1000-кратного разведения очищенных препаратов в ФСБР до финальной концентрации 1 нг/мкл. Методом последовательных двукратных разведений тем же буфером получали пять тестовых образцов с концентрациями 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5 и 1 нг/мкл. Далее аликвоты полученных растворов объемом 200 мкл вносили в лунки черного 96-луночного планшета (Greiner Bio-One, Германия). Измерения проводили в режиме сканирования с регистрацией спектров возбуждения и эмиссии в диапазоне от 340 до 740 нм. Для каждого белка определяли спектры возбуждения при фиксированной длине волны эмиссии, спектры эмиссии при фиксированной длине волны возбуждения и оптимальные пары длин волн возбуждения/эмиссии. Все измерения выполняли при 25 °C в ФСБР (n=3). В качестве фонового контроля использовали лунки с ФСБР.

Связывающую способность гибридных белков с IgG изучали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием очищенных козьих антикроличьих IgG, конъюгированных с HRP (Abcam, США). В лунки 96-луночного иммунологического планшета вносили по 100 мкл растворов белков Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 в начальных концентрациях 470 и 250 нг/мкл соответственно с последующим серийным разведением в ФСБР, после чего инкубировали в течение 1 ч и 500 об/мин при 37 °C.

Для предотвращения неспецифического связывания поверхность лунок обрабатывали 250 мкл «блокирующим раствором» ФСБР, содержащим 1% БСА (Amresco, США) и 0,05% Tween-20 (ООО «Компания Хеликон»), в течение 1 ч при 37 °C. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора очищенных HRP-меченных козьих антикроличьих IgG (разведение 1:2500 в блокирующем растворе) и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C при перемешивании. После инкубации лунки планшета 4 раза промывали 300 мкл ФСБР, содержащим 0,05% Tween-20 с использованием автоматической промывочной станции Bio-Plex Pro Wash Station (Bio-Rad, США). Далее в лунки вносили по 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (Sigma-Aldrich, США) и через 10 мин реакцию останавливали добавлением 100 мкл 2 M HCl.

Оптическую плотность растворов измеряли при длине волны 450 нм с использованием планшетного ридера iMark (Bio-Rad). В качестве контроля неспецифического связывания использовали лунки без сорбированных гибридных белков.

Способность Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 связываться с IgG оценивали методом иммунофлуоресцентного анализа. В качестве антигена использовали БП-БСА. В лунки черного 96-луночного планшета вносили по 200 мкл раствора конъюгата в ФСБР (5 нг/мкл). Планшет инкубировали в течение 16 ч при 25 °C в месте, полностью защищенном от света. После удаления раствора БП-БСА вносили блокирующий раствор в объеме 250 мкл и инкубировали в течение 1 ч и 500 об/мин при 37 °C. Затем в лунки вносили 200 мкл серийных разведений иммунной сыворотки кролика. В эксперименте использовали один аликвотный образец сыворотки крови кролика, иммунизированного конъюгатом БП-БСА. Цельную сыворотку крови последовательно разводили ФСБР с шагом в два раза, начиная с разведения 1:10 и заканчивая разведением 1:320. Инкубацию с сывороткой проводили в течение 1 ч и 500 об/мин при 37 °C. После этого лунки 4 раза промывали 300 мкл ФСБР, содержащим 0,05% Tween-20, с использованием автоматической промывочной станции Bio-Plex Pro Wash Station. Для оценки фонового сигнала использовали контрольные лунки двух типов: с иммобилизованным антигеном (без сыворотки) и без антигена и сыворотки (только блокирующий раствор). Для выявления связавшихся антител в лунки добавляли 200 мкл раствора белка Z‑mHoneydew или Z‑CyOFP1 в концентрации 100 нг/мкл каждый и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C при перемешивании. После завершения инкубации лунки 4 раза промывали 200 мкл ФСБР, содержащим 0,05% Tween-20. Флуоресцентный сигнал белков регистрировали на мультимодальном микропланшетном ридере ClarioStar Plus (BMG Labtech, Германия) при 25 °C: Z‑mHoneydew — длина волны возбуждения 481 нм и эмиссии 538 нм; Z‑CyOFP1 — длина волны возбуждения 514 нм и эмиссии 590 нм.

Ген Z‑домена белка А и гены флуоресцентных белков mHoneydew [25] и CyOFP1 [26] амплифицировали методом ПЦР. После очистки ПЦР-продукты были клонированы в плазмидный вектор pCCO [27] под контролем промотора Т5. Плазмидные конструкции содержали гены, кодирующие Z‑домен и флуоресцентные белки, соединенные линкером, который кодирует пептид Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly, обозначенный как (Ser3Gly)2 (рис. 1А). Корректность сборки генетических конструкций pCCO-Z‑mHoneydew и pCCO-Z‑CyOFP1 подтверждали секвенированием генов плазмидных конструкций и ПЦР-анализом плазмидных конструкций с последующим электрофоретическим разделением ПЦР-продуктов — генетических вставок. Размеры генетических вставок Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 находились в диапазоне от 1000 до 1500 п.н. (рис. 1В), что согласуется с теоретически предсказанными значениями 1077 и 1071 п.н. для Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 соответственно. Окончательную проверку сборки плазмидных конструкций провели путем секвенирования целевых генов. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с расчетными подтвердило корректность сборки конструкций, а именно: вставки имели правильную ориентацию, не содержали делеций и инсерций, рамка считывания сохранялась.

Из культуры объемом 1 л среды LB получено ~37 мг белка Z‑mHoneydew с чистотой ~90% по данным денситометрического анализа ДСН-ПААГ и ~6 мг Z‑CyOFP1 с чистотой ≥90%. Гибридные белки имели молекулярную массу около 35 кДа (рис. 2), что соответствует теоретически предсказанным значениям 34,7 и 34,9 кДа для Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 соответственно.

Изучение флуоресцентных свойств гибридных белков включало следующие этапы: измерение интенсивности флуоресценции при различных концентрациях белка (серийные разведения) и сканирующей спектрофлуориметрии в диапазоне от 340 до 740 нм для определения оптимальных длин волн возбуждения и эмиссии. Измерения для каждого разведения проводили в трех повторах. Полученные при сканировании гибридного белка Z‑mHoneydew данные (рис. 3A) сравнивали с известными данными сканирования нативного белка mHoneydew, спектральные характеристики которого взяты из открытой базы данных Fluorescent protein database4: максимумы возбуждения и эмиссии mHoneydew наблюдаются при длинах волн 480 и 562 нм соответственно. На рисунке 3А показано, что Z‑mHoneydew при pH 7,5 имеет совпадающий максимум возбуждения при 480 нм, однако наблюдается сдвиг максимума эмиссии от 562 к 536 нм по сравнению с нативным mHoneydew. Сдвиг наблюдается и при более низких концентрациях белка Z‑mHoneydew. При использовании Z‑mHoneydew в качестве флуоресцентной метки в иммуноанализе детекцию сигнала можно проводить при длине волны 536 нм.

На рисунке 3В показано сравнение спектральных характеристик гибридного белка Z‑CyOFP1 при pH 7,5 с данными спектральных характеристик нативного CyOFP1, взятых из Fluorescent protein database: максимумы возбуждения и эмиссии наблюдаются при 497 и 588 нм соответственно. Из рисунка видно, что максимум возбуждения Z‑CyOFP1 смещается в длинноволновую область от 497 к 515 нм. Подобный сдвиг имеет место и при более низких концентрациях белка, но максимум эмиссии Z‑CyOFP1 и CyOFP1 остается при длине волны 588 нм. Наблюдаемые сдвиги спектров возбуждения и эмиссии гибридных белков предположительно обусловлены влиянием относительно небольшого Z‑домена на конформацию β-бочонка флуоресцентного белка, формирующего микроокружение хромофора. Выбор длины волны 515 нм возбуждения является оптимальным для иммунофлуоресцентного анализа с использованием Z‑CyOFP1.

Поскольку Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 содержат Z‑домен белка А в дополнение к флуоресцентным белкам, необходимо проверить их способность связываться с IgG. Взаимодействие изучали методом прямого ИФА в трех независимых повторах. В лунки иммунологического планшета вносили серийные разведения гибридных белков, после чего добавляли очищенные HRP-меченные козьи антикроличьи IgG. Меченые антитела дозозависимо связывались с обоими белками (рис. 4). Линейная зависимость связывания наблюдается для Z‑mHoneydew в диапазоне от 30 до 235 нг/мкл, для Z‑CyOFP1 — от 15 до 250 нг/мкл. Высокие значения коэффициентов детерминации 0,97 (Z‑mHoneydew) и 0,96 (Z‑CyOFP1) указывают на хорошее качество аппроксимации и демонстрируют зависимость сигнала ИФА от концентрации гибридных белков.

Для обнаружения IgG с использованием флуоресцентно-меченных гибридных белков в лунки с сорбированным конъюгатом БП-БСА вносили образцы сыворотки крови иммунизированных кроликов в разных разведениях. После инкубации добавляли Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 и измеряли сигналы флуоресценции в трех независимых наблюдениях. Изменение интенсивности флуоресценции коррелировало с разведением сыворотки, что отражало наличие IgG, специфических к БП-БСА (рис. 5). В контрольных лунках планшета, блокированных БСА и содержащих сорбированный антиген, но без добавления сыворотки, флуоресцентный сигнал соответствовал фоновым значениям. Фоновый сигнал составил 2316 относительных единиц (отн. ед.) флуоресценции при длинах волн 480 нм (возбуждение) и 536 нм (эмиссия) для Z‑mHoneydew. Фоновый сигнал составил 2568 отн. ед. флуоресценции при длинах волн 515 нм (возбуждение) и 588 нм (эмиссия) для Z‑CyOFP1.

Представленные на рисунке 5 величины были скорректированы путем вычитания значений фонового сигнала контрольных лунок. Для проверки неспецифического взаимодействия гибридных белков с БСА получены значения фонового сигнала блокированных БСА лунок планшета, не содержащих сорбированный антиген и сыворотку: для Z‑mHoneydew флуоресцентный сигнал составил 2730 отн. ед. флуоресценции при длинах волн возбуждения 480 нм и эмиссии 536 нм; для Z‑CyOFP1 — 2601 отн. ед. флуоресценции при длинах волн возбуждения 515 нм и эмиссии 588 нм. Наблюдалась четкая зависимость интенсивности флуоресценции от разведения сыворотки (рис. 5), отражающая содержание IgG, специфических к БП-БСА. Данные иммунофлуоресцентного анализа подтвердили возможность обнаружения IgG в модельной системе с использованием гибридных белков. Аппроксимация данных позволила выявить участок линейной зависимости в диапазоне разведений сыворотки 1:10–1:160 (Z‑mHoneydew) и 1:10–1:80 (Z‑CyOFP1). Данные указывают на свойство белков к обнаружению специфических IgG в сыворотке крови.

Таким образом, слияние с Z‑доменом не приводит к потере флуоресцентных характеристик mHoneydew и CyOFP1. Свойство изученных гибридных белков связывать IgG позволяет рассматривать их в качестве перспективных детектирующих реагентов в флуоресцентном иммуноанализе.

Создание гибридных белков, которые выполняют связывающие и детектирующие функции, является перспективным направлением в молекулярной иммунологии. Наша работа показывает, что Z‑домен белка A S. aureus может быть успешно использован в качестве основы для создания флуоресцентных реагентов при обнаружении IgG. Экспериментально подтверждена способность гибридных белков Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 специфически взаимодействовать с очищенными HRP-меченными IgG и поликлональными IgG сыворотки крови. Белки сохраняют флуоресцентные свойства, демонстрируя лишь незначительные спектральные сдвиги относительно исходных флуоресцентных белков. Результаты дополнительных экспериментов указывают на отсутствие нарушений в пространственной структуре обоих доменов в составе сконструированных белков. Полученные гибридные белки сочетают неизменную специфичность Z‑домена к IgG с флуоресцентными свойствами. Подобные белки упомянуты в ограниченном числе публикаций, например в контексте создания люциферазных гибридных белков на основе Z‑домена [28]. Следует отметить, что и рекомбинантные флуоресцентные конструкции, аналогичные разрабатываемым, были ранее описаны в литературе [29]. Несмотря на имеющиеся аналоги, меченные EGFP (enhanced green fluorescent protein), ключевым отличием нашей работы является целенаправленное конструирование рекомбинантных реагентов, отличающихся универсальностью и адаптивностью, для определения сывороточных IgG иммунофлуоресцентным методом.

Помимо детекции IgG, специфичных к различным антигенам, созданные иммунореагенты позволяют регистрировать сигнал иммунных комплексов. В частности, ключевым преимуществом гибридного белка Z‑mHoneydew является широкий спектральный диапазон 481–507 нм (возбуждение) и 536–562 нм (эмиссия). Использование mHoneydew в качестве метки открывает возможности для детекции антител по флуоресцентному сигналу на оборудовании с разными оптическими конфигурациями за счет широких диапазонов возбуждения/эмиссии флуоресцентного белка. Параллельно создан рекомбинантный белок Z‑CyOFP1, который в перспективе может быть использован в FRET-анализе (Förster resonance energy transfer). Флуоресцентный белок CyOFP1 в составе рекомбинантного гибридного белка Z‑CyOFP1 может служить эффективным флуорофором-акцептором, что в комбинации с подходящим флуорофором-донором позволит изучать динамику формирования иммунных комплексов [30][31].

Исследование имеет ряд ограничений. Основным подтверждением функциональности Z‑домена белка A в составе гибридных белков Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 послужили данные о взаимодействии с очищенными HRP-меченными IgG и поликлональными IgG в сыворотке крови кроликов, иммунизированных антигеном БП-БСА. Однако остается не охарактеризованной аффинность взаимодействий (равновесные константы диссоциации) комплексов созданных гибридных белков с IgG, что затрудняет постановку количественного иммунофлуоресцентного анализа. Кроме того, не изучена стабильность белков при различных условиях хранения (температура, pH, циклы замораживания-оттаивания) и структурная целостность белков в динамике, что напрямую определяет воспроизводимость и надежность анализа. Еще одно ограничение заключается в том, что гибридные белки не апробированы на сыворотках крови человека; это не позволяет оценить их реальную диагностическую ценность.

В перспективе авторы планируют провести анализ диагностической эффективности на клинических образцах сывороток в условиях реальной диагностической задачи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.М. Елисейкин, А.Е. Студенников, А.Н. Глушков — формирование концепции работы; А.М. Елисейкин — написание текста рукописи, формулирование выводов; А.М. Елисейкин, И.В. Маргатский, В.Е. Артемов, А.В. Марущак, И.С. Понкратенко — дизайн и выполнение экспериментов; А.Н. Глушков — формулирование выводов, утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Благодарности. Коллектив авторов благодарит В.А. Устинова и И.С. Гребенщикова за ценные консультации при обсуждении результатов проведенного исследования.

Author contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. A.M. Eliseykin, A.E. Studennikov, A.N. Glushkov conceptualised the study. A.M. Eliseykin drafted the manuscript and formulated the conclusions. A.M. Eliseykin, I.V. Margatskiy, V.E. Artemov, A.V. Marushchak, I.S. Ponkratenko developed the design and conducted the experiments. A.N. Glushkov formulated the conclusions and approved the final version of the manuscript for publication.

Acknowledgements. The authors express their gratitude to V.A. Ustinov and I.S. Grebenshchikov for valuable advice when discussing the study results.

1. Студенников АЕ. Антитела к полициклическим ароматическим углеводородам и антиидиотипические антитела к ним: получение, характеристика, применение: дис. … канд. биол. наук. Кемерово; 2022.2. https://alphafoldserver.com3. Там же.4. https://www.fpbase.org