Производство гриппозных вакцин сопровождается рисками контаминации готовой продукции возбудителями зоонозных инфекций, в частности лейкозом птиц, аденовирусной инфекцией и микоплазмозом птиц, поскольку основным сырьем при производстве вакцины являются куриные эмбрионы. Для производства инактивированных гриппозных вакцин необходимо большое количество яиц, поэтому требование об использовании куриных эмбрионов, полученных от стад, свободных от патогенной микрофлоры (specific pathogen free, spf), практически нецелесообразно1. Несмотря на то, что куриные эмбрионы должны быть получены из хозяйств, благополучных по возбудителям, патогенным для человека2, риск контаминации сохраняется. Следовательно, необходимо доказать, что выбранный метод инактивации вируса гриппа обеспечивает также инактивацию других потенциально опасных для человека патогенов, включая микоплазмы птиц3.

У птиц обнаружено 23 вида микоплазм, из которых наиболее патогенными и распростра­ненными являются Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae, M. iowae и M. meleagridis [1]. Некоторые штаммы этих микоплазм сохраняют жизнеспособность на слизистой оболочке носа человека до 24 ч после экспериментальной инокуляции [2]. M. gallisepticum и M. synoviae являются единственными из контролируемых микоплазм у стад кур, свободных от специфической патогенной микрофлоры, используемых для производства и контроля качества вакцин согласно Европейской фармакопее, в связи с чем они считаются приемлемыми объектами для выполнения оценки контаминации вакцин против гриппа [3].

M. gallisepticum и M. synoviae могут распространяться как горизонтальным, так и вертикальным (трансовариальным) путем и хорошо выживают в аллантоисной жидкости и желтке куриного эмбриона [4]. Микоплазмы не имеют клеточной стенки, ограничены трехслойной мембраной, что обусловливает их неустойчивость к факторам внешней среды, где они погибают за короткий срок. Устойчивость микоплазм к способам инактивации зависит от используемых реагентов и условий [3][5]. Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохра­нения (ВОЗ) выбранный метод инактивации должен обеспечивать инактивацию потенциально опасных для человека патогенов, включая микоплазмы птиц4.

Для расщепления вируса гриппа в производстве вакцин применяют формальдегид, β-пропиолактон (BPL) или ультрафиолетовое (УФ) облучение [6–8]. BPL инактивирует вирусы гриппа полнее и быстрее формалина, обеспечивая безопасность и антигенность вакцины. Выбор концентрации BPL (0,09%) основан на требованиях Европейской фармакопеи, производственных протоколах [9–11] и данных о том, что снижение концентрации BPL до 0,05% недостаточно для удаления микоплазменных контаминантов из богатых белком сред. Инкубация при температуре 4 °C резко уменьшает микоплазмоцидную активность BPL [3] и предпочтительна для снижения роста бионагрузки в процессе производства гриппозных вакцин.

Ультрафиолетовое облучение применяется как антимикробная мера более 100 лет; чувствительность вирусов гриппа к УФ не меняется, поэтому ожидается, что эффективность УФ в отношении новых штаммов вируса сохранится [12]. Выбор параметров УФ-облучения (мощность 60 Вт при толщине слоя контаминированных полупродуктов ≤1,1 мм) обусловлен конструктивными особенностями промышленных установок, используемых при производстве гриппозных вакцин.

Для расщепления вируса гриппа также используют детергенты: катионные (тетрадецилтриметиламмония бромид, цетилтриметил­аммония бромид), анионные (дезоксихолат натрия, н-октил-β-D-глюкопиранозид), неионные (октоксинол 10, полисорбат 80) [8–10]. Микоплазмоцидная активность цетилтриметиламмония бромида, дезоксихолата натрия и октоксинола 10 была показана ранее [3]. Концентрации детергентов могут варьировать в зависимости от протоколов производства вакцин. Выбранные в работе концентрации являются наиболее распространенными в производстве гриппозных вакцин [13][14].

Актуальность данной работы обусловлена распространением микоплазмоза птиц: серопревалентность к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц в хозяйствах яичного направления, откуда поступают куриные эмбрионы, за пятилетний период варьировала от 16,70 до 61,50%, к возбудителю инфекционного синовита — от 50,00 до 78,57%5.

Цель работы — оценить динамику инактивации M. gallisepticum и M. synoviae в полупродуктах гриппозных вакцин при воздействии β-пропиолактона, ультрафиолетового облучения и детергентов (н-октил-β-D-глюкопиранозид, тетрадецилтриметиламмония бромид) для определения эффективности этих воздействий в условиях производства вакцин.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи: накопить штаммы M. gallisepticum и M. synoviae в концентрации не менее 4 lg КОЕ/мл; провести контаминацию полупродуктов гриппозных вакцин, содержащих вирус гриппа человека; оценить снижение жизнеспособности микоплазм при воздействии инактиваторов и детергентов, используемых при производстве гриппозных вакцин, эффективность которых ранее не изучалась.

Материалы

Методы

Получение полупродуктов гриппозных вакцинПолучение вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). 9–11-дневные куриные эмбрионы заражали актуальными рекомендованными ВОЗ вакцинными штаммами вируса гриппа человека (доза: 0,2 мл c инфекционной активностью 102,0–104,5 ЭИД50). Инкубацию проводили при 35 °C в течение 48 ч для вируса гриппа А и в течение 72 ч — для вируса гриппа В. После инкубации эмбрионы охлаждали и собирали ВАЖ [6][15][16].Получение вирусных концентратов (ВК). ВАЖ фильтровали через каскад фильтров (диаметр пор 10, 6 и 1 мкм) с последующим концентрированием с использованием ультрафильтрационной установки (предел отсечения 300 кДа). Далее ВАЖ ультрацентрифугировали в градиенте плотности сахарозы (60–20%) и собирали фракции 40–25% сахарозы. ВК разводили до 1,0 мг/мл (для УФ-облучения) и до 1,5 мг/мл (для обработки детергентами) [15][16]. Для экспе­риментов с детергентами предварительно инактивировали вирус гриппа на стадии ВАЖ для моделирования процессапроизводства.Культивирование M. gallisepticum и M. synoviae

Для исключения возможности контаминирования гриппозных вакцин потенциально опасными для человека патогенами необходимо обеспечить снижение нагрузки контаминанта не менее чем на 4 lg. Этот критерий (снижение на 4 lg и более) ранее использован в работах по инактивации возбудителей лейкоза и аденовируса птиц [15][16] и свидетельствует о выраженной эффективности в отношении исследуемого патогена6. Поэтому накапливали микоплазмы до концентрации ≥4 lg КОЕ/мл.

Для накопления и культивирования M. gallisepticum и M. synoviae использовали жидкую питательную среду на основе Mycoplasma Broth Base (HiMedia, Индия), лошадиной сыворотки (АО «НПО «Микроген», Россия), экстракта дрожжей (HiMedia, Индия), глюкозы (кат. № 143140, PanReac, Испания), оксациллина (ОАО «Синтез», Россия) и 1% фенолового красного (кат. № UVCH-5170, ООО «Невареактив», Россия)7. Проводили серийные десятикратные разведения. Для контроля процесса роста культуры использовалась неинокулированная пробирка с ростовой средой.

M. gallisepticum инкубировали в течение 7 сут в аэробных условиях при температуре 37±1 °C(ОАО «Смоленское СКТБ СПУ», Россия). Рост оценивали по мутности и изменению цвета среды с красного на желтый. В первых разведениях штамма M. gallisepticum наблюдали повышение мутности и изменение цвета через 48–72 ч, в последующих пассажах — через 24–48 ч.

M. synoviae инкубировали в течение 14 сут при температуре 37±1 °C. Повышение мутности первых разведений штамма наблюдали через 13–14 сут; цвет среды приобретал слабо-оранжевый оттенок.

Оценка динамики инактивации

Оценку динамики инактивации микоплазм осуществляли путем определения концентрации колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) M. gallisepticum и M. synoviae в отобранных в разные периоды времени пробах с использованием чашечного метода на жидкой питательной среде для накопления микоплазм с добавлением 1,3% агара8. Готовую плотную среду разливали по 7–9 мл в чашки Петри (диаметр 60 мм). Избыток влаги удаляли короткой инкубацией при 37 °C. Чашки хранили при температуре 2–8 °C до 14 сут.

Для оценки жизнеспособности бульонную культуру микоплазм (0,2 мл) наносили на агар и равномерно распределяли. Чашки переворачивали и помещали в термостат для инкубации. Показатель КОЕ/мл определяли поверхностным методом посева десятикратных разведений бульонной культуры на плотную питательную среду с последующей инкубацией и подсчетом колоний (каждая колония — из одной жизнеспособной клетки); из каждого разведения делали параллельные высевы на несколько чашек.

Чашки инкубировали, используя газогенерирующие пакеты Anaerocult C mini (аэрофильные условия). Через 7 сут поверхность агара просматривали под микроскопом Eclipse E200 (Nicon, Япония; увеличение 40× и 100× в косопроходящем свете), определяли среднее количество колоний, выросших при посеве каждого разведения. Значение КОЕ/мл выражали в lg; снижение показателя рассчитывали как разность между lg КОЕ/мл до и после инактивации.

Оценка инактивации микоплазм β-пропиолактоном в вируссодержащей аллантоисной жидкости. Эксперимент проводили на трех сериях ВАЖ [15][16]. Исследовательские образцы контаминировали M. gallisepticum или M. synoviae. Далее проводили инактивацию BPL: к 45,0 мл ВАЖ добавляли 5,0 мл культуры микоплазм, 2,5 М NaCl (0,23 М) и BPL (до конечной концентрации 0,09%). В образцы положительного контроля вместо BPL вносили фосфатно-буферный раствор (ФБР, рН 7,2–7,6, кат. № В60201, ООО «Эко-сервис», Россия) в объеме, равном BPL. Образцы отрицательного контроля готовили аналогично исследовательским образцам, вместо культуры ми­коплазм вносили 5,0 мл ФБР. Далее все образцы выдерживали при температуре 4 °C в течение 12 ч с перемешиванием в первые 2 ч. Отбор образцов проводили через 0, 4, 6, 10 и 12 ч после сведения всех компонентов. Все эксперименты выполняли в трех повторностях. Расчет доверительного интервала проводили с использованием коэффициента Стьюдента при доверительной вероятности 95%.

Оценка инактивации микоплазм в вирусных концентратах с помощью ультрафиолетового облучения. Эксперимент проводили на трех сериях ВК [15][16]. Исследовательские образцы контаминировали M. gallisepticum или M. synoviae. Далее проводили УФ-облучение с помощью бактерицидных ламп (15W G13 G15T8/OF, Россия). К 36,0 мл ВК добавляли 4,0 мл культуры микоплазм. Каждый образец разливали по 7 мл в пять чашек Петри (диаметр 9 см, толщина слоя ≤1,1 мм). Чашки помещали под установкой из четырех ламп (общая мощность 60 Вт) на расстоянии 20 см, изолировали фольгой для минимизации рассеивания УФ-облучения. Инактивацию проводили при температуре 18 °C при облучении по следующей схеме: 1-я чашка — 0 с; 2-я чашка — 30 с; 3-я чашка — 1 мин; 4-я чашка — 2 мин; 5-я чашка — 5 мин. В качестве положительного контроля служили чашки с исследовательским образцом без облучения. В отрицательном контроле вместо культур микоплазм добавляли 4,0 мл ФБР. Эксперименты выполняли в трех повторностях. Доверительный интервал рассчитывали с использованием коэффициента Стьюдента при доверительной вероятности 95%.

Оценка динамики инактивации микоплазм н-октил-β-D-глюкопиранозидом в вирусных концентратах. Эксперимент проводили на трех сериях ВК. Исследовательские образцы ВК с концентрацией белка 1,5 мг/мл контаминировали M. gallisepticum или M. synoviae. К 13,5 мл ВК добавляли 1,5 мл культуры микоплазм и 1,5 мл ФБР с 162 мг OGP. К положительному контролю вместо OGP добавляли 1,5 мл ФБР. К отрицательному контролю вместо культур микоплазм добавляли 1,5 мл ФБР. Далее образцы инкубировали при температуре 18 °C в течение 60 мин с периодическим отбором проб для определения КОЕ. Эксперименты выполняли в трех повторностях. Доверительный интервал рассчитывали с использованием коэффициента Стьюдента при доверительной вероятности 95%.

Оценка динамики инактивации микоплазм тетрадецилтриметиламмоний бромидом в вирусных концентратах. Исследовательские образцы ВК (концентрация белка 1,5 мг/мл) контаминировали M. gallisepticum или M. synoviae. К 13,5 мл ВК добавляли 1,5 мл культуры микоплазм и 0,1 мл ФБР с 10,0 мг TTAB. К положительному контролю вместо TTAB добавляли 1,5 мл ФБР. К отрицательному контролю вместо культур микоплазм добавляли 1,5 мл ФБР. Эксперименты выполняли в трех повторностях. Доверительный интервал рассчитывали с использованием коэффициента Стьюдента при доверительной вероятности 95%.

Полная инактивация микоплазм M. gallisepticum и M. synoviae в ВАЖ под действием BPL с концентрацией 0,09% достигалась за 4 ч (табл. 1).

После воздействия УФ-облучения полная инактивация M. gallisepticum в вирусных концентратах происходила через 1 мин, M. synoviae — через 30 с (табл. 2).

Под влиянием детергентов OGP (соотношение белок:детергент — 1:8) и TTAB (соотношение 1:0,5) полная инактивация M. gallisepticum и M. synoviae в вирусных концентратах происходила мгновенно (табл. 3).

После внесения BPL в контаминированную ВАЖ в первые минуты контакта жизнеспособность M. gallisepticum снижалась на 1,88±0,41 lg КОЕ/мл, а M. synoviae — на 2,17±0,37 lg КОЕ/мл (табл. 1). Инкубация контаминированных ВАЖ с BPL в холодильной камере при температуре 4 °C в течение 4 ч приводила к снижению жизнеспособности M. gallisepticum на 6,53±0,08 lg КОЕ/мл, а M. synoviae — на 5,70±0,09 lg КОЕ/мл (табл. 4).

УФ-облучение концентратов вируса гриппа с концентрацией белка не более 1 мг/мл за 1 мин экспозиции приводило к снижению количества жизнеспособных M. gallisepticum на 6,67±0,01 lg КОЕ/мл, за 0,5 мин экспозиции с M. synoviae на 5,70±0,09 lg КОЕ/мл (табл. 4).

Согласно данным проведенных ранее исследований [15][16], снижение титра аденовируса и вируса лейкоза на 4 lg под действием BPL происходило через 10 и 12 ч соответственно, а под действием УФ-облучения — через 5 мин (табл. 4). Наши результаты согласуются с данными предыдущих исследований [3], в которых установлено, что 22 вида микоплазм, включая птичьи микоплазмы M. gallisepticum, M. synoviae, M. iowae и Acholeplasma laidlawii, могут быть полностью инактивированы в течение 3–24 ч при комнатной температуре в среде для микоплазм, содержащей 0,2% формальдегида и 0,1% BPL. Инактивация M. gallisepticum ATCC 19610 с использованием 0,05% BPL в полупродукте гриппозных вакцин при комнатной температуре достигалась за 3 чна 8 lg КОЕ/мл.

Сопоставление с данными литературы по влиянию УФ-облучения на микоплазмы затруднено из-за различия параметров УФ-облучения или использования других типов образцов и микоплазм. Так, в работе R.B. Kundsin [17] показано, что летальное действие УФ-облучения (лампа General Electric с горячим катодом G 15 T8, излучающая 25 мкВт на см² на 1 м при 90% выходной мощности при 2537 А) на аэрозоли микоплазм (M. hominis, M. pharyngis, M. pneumoniae) в воздухе являлось мгновенным и чрезвычайно эффективным (99,9%).

В исследовании M. Mizuno с соавт. [18] в отношении высушенной культуры M. orale (6 lg КОЕ/200 мкл), помещенной в бокс, оснащенный бактерицидной лампой UV-C мощностью 15 Вт (Sankyo Denki Co., Канагава, Япония), показана эффективная инактивация в течение 20 мин, но ее динамика продемонстрирована не была. В другом исследовании [19] описан инновационный подход к инактивации M. gallisepticum с использованием гидрофобного фотоиндуцированного алкилирующего зонда 1,5-йодонафтилазида, при котором обработка культуры в середине экспоненциальной фазы (0,2 мг белка/мл) с последующим УФ-облучением (310–380 нм) приводила к полной утрате ее жизнеспособности. Однако использование только УФ-облучения безозоновой ртутной дуговой лампой мощностью 100 Вт с собирающей линзой и фильтром (310 нм) на расстоянии 18 см в течение 2 мин оказало незначительное влияние на жизнеспособность M. gallisepticum — снижение на 2–3 lg КОЕ/мл через 4 мин облучения.

В нашем исследовании показано, что оба детергента (OGP и TTAB) инактивировали ми­коплазмы птиц в первые минуты после начала контакта. Для сравнения, по данным предыдущих исследований [15] снижение титра аденовируса под действием детергентов (OGP и TTAB) на 1 lg бляшкообразующих единиц на 1 мл происходило через 1 ч.

В работе S.A. David с соавт. [3] катионный детергент цетилтриметиламмоний бромид (0,075–0,15%) почти сразу инактивировал все тес­тированные микоплазмы, включая M. gallisepticum,M. synoviae, аналогично TTAB (0,07%) (табл. 3). Анионный детергент дезоксихолат натрия (0,5%) мгновенно инактивировал протестированные микоплазмы, включая M. gallisepticum, M. synoviae [3], аналогично OGP (0,98%) (табл. 3).

Таким образом, BPL, УФ-облучение, TTAB и OGP эффективны в отношении микоплазм птиц M. gallisepticum и M. synoviae. С учетом данных исследований по инактивации аденови­-русов и вируса лейкоза птиц [15][16] можно заключить, что для обеспечения должного уровня безопасности при производстве гриппозных вакцин необходимо проводить инактивацию 0,09% BPL не менее 12 ч, а УФ-облучением — не менее 5 мин. Стадия расщепления вируса гриппа детергентами дополнительно снижает инфекционную нагрузку [15][16]. Таким образом, согласно результатам данной работы и предыдущих исследований [15][16] при производстве гриппозных вакцин микоплазмы птиц оказались наименее устойчивыми среди исследованных контаминантов, а самым устойчивым контаминантом являлся возбудитель лейкоза птиц.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Н.Н. Савина — дизайн исследования, анализ данных, интерпретация результатов, формулировка выводов, написание и редактирование текста рукописи; М.Ш. Алиев и А.И. Реутский — работа с источниками литературы, написание текста рукописи; Т.В. Горохова и О.С. Бабкина — производство полупродуктов гриппозных вакцин для исследования, координация работы; С.В. Панкратов — разработка плана исследований, оформление результатов по определению инактивирующей способности химических и физических факторов на M. gallisepticum и M. synoviae; Н.Ю. Серова — накопление культур M. gallisepticum и M. synoviae, определение КОЕ микоплазм.

Использование генеративного искусственного интеллекта. Авторы заявляют, что не использовали генеративный ИИ при подготовке рукописи.

Author contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. N.N. Savina contributed to the study design, data analysis, interpretation of results, formulation of conclusions, and writing and editing of the manuscript. M. Sh. Aliev and A.I. Reutskiy searched and reviewed the literature and drafted the manuscript. T.V. Gorokhova and O.S. Babkina produced influenza vaccine intermediates for the study and coordinated the work. S.V. Pankratov develo­ped the research plan and compiled the results on the inactivating capacity of chemical and physical factors against M. gallisepticum and M. synoviae. N.Yu. Serova propagated M. gallisepticum and M. synoviae cultures and determined mycoplasma CFU.

Use of generative artificial intelligence. The authors declare that no generative AI was used during the preparation of this manuscript.

1. Recommendations for the production and control of influenza vaccine (inactivated). Annex 3, TRS No 927. WHO. 2005.2. ГОСТ Р 70610-2022 Яйца куриные инкубационные для иммунобиологических производств.ФС.3.3.1.0028.20 Вакцина гриппозная инактивированная. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. 2023.3. Recommendations for the production and control of influenza vaccine (inactivated). Annex 3, TRS No 927. WHO. 2005.2.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia. 11th ed. Suppl. 11.5. 2024.Guideline on influenza vaccines — Quality module (EMA/CHMP/BWP/310834/2012 Rev.1). EMA. 2017.Note for guidance on virus validation studies: The design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses (EMA/CPMP/BWP/268/95). EMA. 1996.4. Recommendations for the production and control of influenza vaccine (inactivated). Annex 3, TRS No 927. WHO. 2005.5. Козлов ДА, Меньщикова АЭ, Брундакова ТН, Волков МС. Серологический мониторинг инфекций птиц микоплазменной этиологии на территории Российской Федерации (2016–2020 гг.). ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». 2022.6. Note for guidance on virus validation studies: The design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses (EMA/CPMP/BWP/268/95). EMA. 1996.7. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. 2023.8. ОФС.1.7.2.0008.15 Определение концентрации микробных клеток. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. 2023.