Терапевтические белки вследствие специфичности, эффективности и безопасности приобретают все большее значение в профилактике и лечении заболеваний. С появлением технологии рекомбинантной ДНК для получения терапевтических белков используются различные системы экспрессии (СЭ) в бактериях, дрожжах, растениях и клетках млекопитающих [1–3]. В отличие от СЭ, в клетках млекопитающих дрожжи растут на недорогих питательных средах и легко поддаются генетическим манипуляциям. В отличие от прокариотической СЭ, дрожжевые клетки обладают эффективной системой секреции, что дает возможность получить правильно свернутый белок c большинством посттрансляционных модификаций, типичных для эукариотических клеток, и проводить менее затратную очистку целевого белка. Дрожжевые клетки не восприимчивы к фагам и эукариотическим вирусам, что является большим преимуществом для фармацевтической промышленности1 [4]. Наиболее часто используемыми дрожжевыми клетками являются Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica и штаммы Kluyveromyces [4–6].

Вид S. cerevisiae является пионером среди дрожжей в получении рекомбинантных белков. Для редактирования полностью расшифрованного генома и метаболической инженерии штаммов S. cerevisiae доступно множество молекулярно-генетических инструментов [7], что делает S. cerevisiae перспективной системой экспрессии для получения различных рекомбинантных белков [8]. S. cerevisiae имеет статус GRAS, что ускоряет одобрение регуляторными органами продуктов, полученных из дрожжей, и снимает ряд нормативных барьеров в процессе разработки биофармацевтических продуктов.

Таким образом, создание универсального дрожжевого штамма-продуцента, соответствующего требованиям регуляторных органов и пригодного для производства различных рекомбинантных белков, остается актуальной задачей биотехнологии, так как единая платформа позволит сократить объем исследований и ускорит процесс выведения продукта на фармацевтический рынок.

Один из ключевых факторов, определяющих эффективность промышленного производства терапевтических белков — это высокая продуктивность штамма-продуцента [9]. Количество синтезируемого рекомбинантного белка тесно коррелирует с удельной скоростью роста клеток, зависит от правильного сворачивания полипептидной цепи, дальнейшего перемещения белка внутри клетки и последующей секреции [6][10]. В дрожжевых СЭ выбор источника углерода существенно влияет на продуктивность, при этом степень воздействия определяется характеристиками используемого промотора [11]. В большинстве случаев в СЭ, основанных на S. cerevisiae, применяются конститутивные промоторы, обеспечивающие стабильную экспрессию белка независимо от условий культивирования. Наиболее используемыми промоторами являются промоторы TPI1, TEF1, ADH2, ALD4 и TDH3 (GPD) [12–22].

Ген TPI кодирует гликолитический фермент триозофосфат-изомеразу. Промотор TPI1 содержит консервативную последовательность ACCCATCA, которая гомологична консенсусным сайтам связывания регуляторных белков GRF1, RAP1 и TUF, а также обнаруживает сходство с регуляторными элементами других генов гликолитического пути. Наличие такой последовательности может объяснить высокий уровень экспрессии данного гена [23]. Штаммы с удаленным TPI не способны метаболизировать глюкозу [24].

Ген TEF1 в S. cerevisiae отвечает за биосинтез eEF1 [25]. Комплекс eEF1 играет центральную роль в синтезе белка, доставляя аминоацил-тРНК к рибосоме в процессе элонгации [26]. Гены TEF принадлежат к большому семейству генов RPG, кодирующих компоненты аппарата трансляции, которые скоординированно регулируются. Большинство дрожжевых RPG содержат UASrpg [27].

Ген алкогольдегидрогеназы 2 (ADH2) — один из многих генов дрожжей, экспрессия которых регулируется в зависимости от присутствия глюкозы в среде. Промотор ADH2 очень удобен для использования при экспрессии гетерологичных генов, поскольку он обеспечивает сильный сигнал начала транскрипции, и транскрипция с промотора ADH2 значимо подавляется в присутствии глюкозы в среде [28].

Цитозольные изоформы альдегиддегидрогеназы дрожжей кодируются генами ALD2, ALD3 и ALD6, тогда как митохондриальные — генами ALD4 и ALD5 [29].

Элементы STRE и факторы транскрипции Msn2 и Msn4, по-видимому, опосредуют активацию генов в ответ на различные стрессы (тепловой шок, окислительный и осмотический стрессы), повреждение ДНК и голодание [30].

Продукт гена GPD (глицерин-3-фосфатдегидрогеназа) катализирует NADH-зависимое превращение DHAP в глицерин-3-фосфат. Активность промотора GPD, обусловленная двумя изоферментами Gpd1p и Gpd2p, важна для роста клеток в анаэробных условиях. Промотор гена GPD является самым сильным среди конститутивных промоторов S. cerevisiae [31–33].

Результаты сравнительных исследований влияния промоторов на экспрессию различных модельных белков (α-амилаза, сывороточный альбумин человека, зеленый флуоресцентный белок) описаны в работах [34–36]. На эффективность экспрессии влияет не только промотор, но и сам экспрессируемый белок [13][21][37–39]. На основании имеющихся данных не представляется возможным сделать однозначный вывод о превосходстве какого-либо типа промотора в отношении эффективности экспрессии гетерологичных белков в системе S. cerevisiae. Следовательно, актуально проведение сравнительного анализа по оценке влияния промоторов на экспрессию различных рекомбинантных белков. Стоит отметить, что подобное исследование не проводилось в отношении большинства терапевтических белков, экспрессируемых в дрожжевых системах экспрессии. В частности, изучено влияние нескольких промоторов на экспрессию проинсулина, но сравнительный анализ различных промоторов в рамках одного исследования не проводился [40]. Использование промоторной последовательности TPI1 для контроля экспрессии позволяет достичь продуктивности 80 мг/л [8][41][42] и 112 мг/л [43]. Использование промотора CIT1 привело к увеличению выхода проинсулина на 80% в сравнении с контролем (промотор TPI1) [44]. При использовании промотора TPI1 удалось достичь максимального выхода проинсулина (90 мг/л), в то время как в случае промотора TEF1 выход составлял 2,5 мг/л [36].

Результаты проведенных исследований не позволяют с уверенностью ранжировать промоторы по транскрипционной активности для экспрессии проинсулина, потому что уровень экспрессии зависит от транскрипционной и трансляционной регуляции. В связи с этим при конструировании дрожжевых штаммов-продуцентов значение имеет рациональный подбор генетических элементов СЭ для достижения максимальной продуктивности.

Нами было выбрано пять промоторов: TEF1, ADH2, ALD4, TDH3 (GPD), TPI1, которые чаще всего используются для экспрессии рекомбинантных белков в дрожжах. Выбор этих промоторов обусловлен доказанной эффективностью применения в биотехнологии, что позволяет провести обоснованное сравнение их эффективности в контексте экспрессии терапевтических белков и выявить наиболее подходящие промоторы для дальнейших исследований.

Цель работы — оценить влияние промоторов TEF1, ADH2, ALD4, TDH3 (GPD), TPI1 на экспрессию рекомбинантного проинсулина человека в Saccharomyces cerevisiae и ранжировать их по силе для выбора оптимального промотора, обеспечивающего максимальную продуктивность.

В работе использовали диплоидный штамм Saccharomyces cerevisiae YS3, который был получен путем слияния гаплоидных клеток S. cerevisiae (MATalpha pep4::HIS3 prb1-delta1.6R his3-delta200 ura3-52 gal2 can1 tpi::URA3) и S. cerevisiae (MATa ura3-52 trp1 lys2-801 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL tpi::KanR).

В качестве вектора для создания экспрессионных конструкций использовали челночную плазмиду pRS425 (ATCC, США), содержащую маркер устойчивости к ампициллину, а также точки начала репликации (ориджин) pUC и 2-μm (рис. 1). Ген предшественника человеческого инсулина с сигнальным пептидом был синтезирован искусственно (ATUM, США) и клонирован в вектор с использованием рестрикционных сайтов SalI и SpeI. Последовательности промоторов и терминаторов транскрипции были получены синтетическим путем (ATUM, США). Последовательности промотора и терминатора гена TPI1 были клонированы рестрикционно-лигазным методом с использованием рестриктаз SacI и BamHI; последовательность промотора TEF1 — SacI/BglII; ADH2 — BspMI/BglII; ALD4 и TDH3 — SacI/BglII.

Трансформацию штамма-хозяина YS3 плазмидой проводили с помощью электропорации [45]. В итоге были получены штаммы-продуценты S. cerevisiae YS3/pF1145, YS3/pF1157, YS3/pF1199, YS3/pF1200, YS3/pF1201, содержащие промоторы TPI1, TEF1, ADH2, ALD4, TDH3 соответственно. Из-за наличия ориджина 2-μm плазмиды реплицировались в клетках дрожжей без интеграции в геном. Для верификации сконструированных штаммов проводили амплификацию целевых участков методом ПЦР и последующее секвенирование (ЗАО «Евроген», Россия).

Культивирование штаммов-продуцентов S. cerevisiae в колбах. В экспериментах использовали стандартную жидкую питательную среду YPD1, содержащую 1% глюкозы [46], а для получения посевного материала — агаризованную среду YPD2, содержащую 2% глюкозы [46]. Инкубацию на агаризованной среде YPD2 проводили в термостате при 30 °C в течение 72 ч. Сформированные колонии смывали жидкой средой YPD1 и переносили в стерильные колбы объемом 100 мл, которые содержали 15 мл той же среды. Культуры инкубировали в среде YPD1 при 30 °C и перемешивании при 210 об/мин в течение 42 ч. В точках роста 18, 24 и 42 ч проводили отбор проб для измерения оптической плотности, содержания белка и этанола в культуральной жидкости.

Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре NanoPhotometer P300 (Implen, Германия). Начальная оптическая плотность клеток при инокуляции составила 0,2–0,5 при длине волны 600 нм.

Уровень глюкозы контролировали с помощью глюкометра Contour TS (Ascensia Diabetes Care, Швейцария) и при необходимости доводили концентрацию глюкозы до 1% с помощью 40%-го рабочего раствора глюкозы.

Подготовка посевного материала для ферментации в биореакторе. В качестве исходного материала для подготовки посевной культуры использовали предварительные клеточные банки штаммов YS3/pF1145 (TPI1) и YS3/pF1145 (TDH3). Клетки инокулировали в 300 мл жидкой среды соответствующего состава без добавления глюкозы [41] и инкубировали при 30±1 °C в шейкер-инкубаторе Ecotron (Infors HT, Швейцария) при 210 об/мин в течение 66–72 ч.

Культивирование в биореакторе. Основной этап культивирования штаммов-продуцентов проводили в течение 96 ч в лабораторных ферментерах Multifors (Infors HT, Швейцария). Состав питательной среды и параметры процесса были выбраны на основе ранее выполненной оптимизации с использованием методологии Design of Experiments для дрожжевых СЭ [41]. Во время ферментации периодически отбирали пробы культуральной жидкости для определения содержания клеточной биомассы, этанола и проинсулина.

Определение массы влажного осадка клеток проводили следующим образом: 2 мл клеточной суспензии переносили в заранее тарированные микропробирки и центрифугировали в течение 5 мин при 15000 об/мин на центрифуге Eppendorf 5424 (Eppendorf, Германия). Супернатант переносили в чистые пробирки для дальнейшего определения содержания этанола и проинсулина.

Определение молекулярной массы рекомбинантного проинсулина в культуральной жидкости проводили методом ВЭЖХ-МС, используя систему Acquity UPLC (Waters, США) с масс-спектрометрическим детектором. Разделение компонентов проводили на колонке SunFire™ C18 (5 мкм, 150×4,6 мм) (Waters, США) с регистрацией сигнала при длине волны 214 нм.

В качестве подвижных фаз использовали фазу А (89,9% вода, 10% ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота) и фазу B (99,9% ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота). Поток подвижной фазы поддерживали на уровне 0,9 мл/мин. Элюирование проводили в градиентном режиме: увеличение концентрации фазы B от 0 до 75% за 18 мин, затем от 75 до 100% за 1 мин с последующим возвращением к исходному составу за 1 мин.

Детектирование осуществляли в режиме положительной ионизации с анализом массы ионов в диапазоне 300–3000 m/z. Каждую серию анализов начинали и завершали введением холостой пробы, в качестве которой использовалась вода для хроматографии, в целях предотвращения перекрестной контаминации. В качестве контрольного образца использовали референсный стандарт инсулина (ООО «ГЕРОФАРМ», Россия).

Определение содержания проинсулина в культуральной жидкости определяли методом ВЭЖХ с использованием системы Acquity UPLC (Waters, США), оснащенной диодно-матричным детектором. Разделение компонентов проводили на колонке SunFire™ C18 (5 мкм, 150×4,6 мм) (Waters, США) с регистрацией сигнала при длине волны 214 нм. В качестве фазы A использовали 3% водный раствор натрия перхлората моногидрата, фазы B — 78% ацетонитрил. Хроматографирование проводили при скорости потока 0,9 мл/мин с использованием градиентной программы: увеличение концентрации фазы B от 20 до 40% за 20 мин, затем от 40 до 95% за 5 мин с последующим возвращением к исходному составу за 1 мин. Количественное определение проводили по калибровочному графику. Калибровка была произведена с использованием стандартного образца инсулина (ООО «ГЕРОФАРМ», Россия).

Анализ внеклеточного метаболита этанола в культуральной жидкости проводили методом газовой хроматографии с использованием хроматографа Agilent 7890A (Agilent Technologies, США), оборудованного пламенно-ионизационным детектором, системой парофазного ввода проб (Agilent 7694E), а также капиллярной колонкой HP FFAP (50 м×0,32 мм×0,5 мкм). Калибровка была произведена с использованием стандартного раствора изопропанола (ООО «Экросхим», Россия) с чистотой ≥99,5%.

Для анализа в парофазные флаконы объемом ~10 мл вносили 1,7 мл предварительно размороженной культуральной жидкости, после чего флаконы герметично закрывали металлическими крышками с силиконовыми прокладками. Пробы инкубировали в пробоотборнике при 85 °C в течение 15 мин, после чего осуществляли забор паровой фазы и ее введение в хроматограф.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., США). Для выявления статистически значимых различий между штаммами по анализируемым показателям применяли дисперсионный анализ. Взаимосвязи между количественными параметрами оценивали с помощью парного корреляционного анализа по методу Пирсона отдельно для каждого исследуемого штамма. Статистически значимыми считались различия при p<0,05.

Были получены дрожжевые штаммы-продуценты S. cerevisiae YS3/pF1145, YS3/pF1199, YS3/pF1157, YS3/pF1200, YS3/pF1201, в которых экспрессия проинсулина находилась под контролем дрожжевых нативных конститутивных промоторов TPI1, TEF1, ADH2, ALD4, TDH3 соответственно.

Подтверждение подлинности продукта проводилось с использованием ВЭЖХ-МС. Экспериментальная масса проинсулина, обнаруженная в культуральной жидкости, имела то же значение, что и экспериментальная масса стандартного образца (рис. 2). Так как аминокислотная последовательность проинсулина не имеет сайтов гликозилирования, на хроматограммах отсутствовали различающиеся по массе гликоформы.

В рамках предварительной оценки полученных штаммов при культивировании в колбах исследовали параметры роста биомассы, накопления этанола и рекомбинантного белка. В качестве контроля использовался штамм YS3/pF1145, экспрессия проинсулина в котором находилась под контролем промотора TPI1. Последовательность данного промотора является «золотым стандартом» для экспрессии рекомбинантных белков в S. cerevisiae [36].

Оценка накопления биомассы штаммами-продуцентами. На рисунке 3 представлена динамика накопления биомассы различными штаммами-продуцентами при культивировании в течение 42 ч.

Анализ результатов показал, что все исследуемые штаммы-продуценты демонстрировали схожую динамику роста на протяжении всего процесса культивирования в колбах. Штаммы различались по титру клеток через 42 ч культивирования при одинаковой плотности посева (5 г/л). Штаммы-продуценты YS3/pF1201 (TDH3) и YS3/pF1145 (TPI1) через 42 ч культивирования накапливали биомассу ≈35 г/л; YS3/pF1200 (ALD4) и YS3/pF1157 (TEF1) — ≈30 г/л; YS3/pF1199 (ADH2) — 42 г/л. Значения биомассы штамма-продуцента YS3/pF1199 (ADH2) значительно варьировались в двух точках (24 и 42 ч), что, возможно, связано с некоторой разницей плотности посева клеток.

Оценка накопления этанола штаммами-продуцентами. На рисунке 4 представлена сравнительная оценка накопления этанола различными штаммами-продуцентами в ходе культивирования. Все измеренные значения были нормированы по отношению к штамму YS3/pF1145 (TPI1) на соответствующем временном интервале.

Практически все штаммы-продуценты (рис. 4) увеличивали содержание этанола в культуральной жидкости. Самые низкие значения содержания этанола через 42 ч культивирования наблюдались для контрольного штамма-продуцента YS3/pF1145 (TPI1), тогда как максимальное накопление этанола было характерно для YS3/pF1199 (ADH2) через 42 ч культивирования и составляло 0,96% (табл. 1). Через 42 ч культивирования содержание этанола составило 0,7–0,8% в случаях остальных штаммов-продуцентов. t-тест показал, что статистически значимых различий между штаммами по накоплению этанола не наблюдалось. Для штамма-продуцента YS3/pF1157 (TEF1) накопление биомассы коррелировало с содержанием этанола в среде (p=0,032).

Оценка накопления проинсулина штаммами-продуцентами. Уровни накопления проинсулина, продуцируемого различными штаммами-продуцентами (измеренные значения пересчитаны относительно YS3/pF1145 (TPI1) для каждой временной точки при культивировании), показаны на рисунке 5.

Наименьшие значения удельной продуктивности в сравнении с остальными штаммами были характерны для контрольного штамма YS3/pF1145 (TPI1) через 42 ч культивирования. Максимальный выход проинсулина у штамма-продуцента YS3/pF1200 (ALD4) составил 16,59±0,02 мг/л (табл. 1) при 0,55±0,01 мг/г биомассы через 42 ч культивирования. Штамм YS3/pF1201 (TDH3) при объемной продуктивности 15,51±0,57 мг/л характеризовался низкой удельной продуктивностью (0,43±0,02 мг/г биомассы), тогда как штамм YS3/pF1157 (TEF1) при низкой объемной продуктивности 12,98±0,08 мг/л характеризовался высокой удельной продуктивностью (0,470±0,003 мг/г биомассы). Большая величина стандартного отклонения уровней накопления биомассы и целевого продукта (проинсулин) для штамма-продуцента YS3/pF1199 (ADH2), возможно, связана с некоторой разницей плотности посева клеток.

Для штаммов-продуцентов YS3/pF1199 (ADH2) и YS3/pF1201 (TDH3) отмечена зависимость между выходом рекомбинантного проинсулина и накоплением биомассы (p=0,020 и p=0,019 соответственно). Однако для всех штаммов-продуцентов не наблюдалось статистически значимой корреляции между выходом проинсулина и содержанием этанола или накоплением биомассы. Сравнение показателей продуктивности и характеристик роста исследуемых штаммов на момент завершения культивирования представлено в таблице 1.

Согласно полученным экспериментальным данным, промоторы по их силе для экспрессии проинсулина можно распределить в следующем ряду: TDH3≈ALD4>ADH2>TEF1>TPI1 (табл. 1). По данным литературы, промотор TDH3 считается одним из самых сильных, однако ранее это не было показано для проинсулина [31–33]. Экспрессия проинсулина под контролем промотора TEF1 была ниже по сравнению с TPI1, что объяснялось высокой скоростью распада мРНК [36]. Такое расхождение с данными литературы может быть обусловлено влиянием других структурных элементов экспрессионной конструкции и особенностями проведения эксперимента.

Таким образом, для дальнейшей работы был выбран штамм YS3/pF1201 (TDH3) по причине его высокой продуктивности и благоприятной динамики накопления биомассы. Штамм YS3/pF1200 (ALD4) характеризовался не меньшей продуктивностью, но низким уровнем накопления биомассы.

Для штамма YS3/pF1201 (TDH3) был получен предварительный банк клеток и проведена ферментация в лабораторном биореакторе. В качестве контроля была поставлена ферментация штамма YS3/pF1145 (TPI1) в аналогичных условиях. Результаты, полученные в процессе ферментации, представлены на рисунке 6.

Стационарная фаза роста штамма YS3/pF1201 (TDH3) наблюдалась через 50 ч культивирования, максимальное накопление проинсулина наблюдалось через 72 ч культивирования. В выбранных условиях ферментации максимальное значение продуктивности составляло 139,17 мг/л при значении биомассы 154,5 г/л. Стационарная фаза роста контрольного штамма YS3/pF1445 (TPI1) наблюдалось через 72 ч культивирования, при этом максимальное значение продуктивности (23 мг/л) было достигнуто через 50 ч культивирования, после чего данный показатель снижался.

Таким образом, для штамма YS3/pF1201 (TDH3) наблюдались более высокие значения продуктивности и накопления биомассы по сравнению с контрольным штаммом YS3/pF1145 (TPI1). Это может быть связано с тем, что экспрессия проинсулина штаммом YS3/pF1201 (TDH3) в меньшей степени репрессируется глюкозой.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.А. Буслаева — идея, планирование и проведение экспериментов, анализ данных, написание текста рукописи; З.Р. Хасаншина — планирование и анализ данных эксперимента, написание текста рукописи; И.А. Корнаков — проведение экспериментов по культивированию; М.П. Коробкина — проведение высокоэффективной жидкостной хроматографии; В.И. Шмурак — проведение хромато-масс-спектрометрии; Р.В. Драй — определение основного направления исследования, утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Благодарности. Исследование проводилось при спонсорской поддержке ООО «ГЕРОФАРМ». Авторы выражают признательность коллегам, которые оказывали помощь в выполнении исследования, сотрудникам лаборатории генной инженерии и ферментации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. E.A. Buslaeva suggested the study idea, planned and carried out experiments; analysed data; and drafted the manuscript. Z.R. Khasanshina conceptualised, planned experiments, analysed experimental data, and drafted the manuscript. I.A. Kornakov carried out cultivation experiments. M.P. Korobkina performed high-performance liquid chromatography. V.I. Shmurak performed liquid chromatography-mass spectrometry. R.V. Drai set the main research direction and approved the final version of the manuscript for publication.

Acknowledgements. The study was supported by GEROPHARM. The authors are grateful to their colleagues from the Laboratory for genetic engineering and fermentation who helped them with this study.

1. Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. International council for harmonization of technical requirements for pharmaceuticals for human use. ICH Q5A(R2). Geneva; 2022.