Генная терапия (ГТ) направлена на манипуляцию экспрессией определенного гена или на изменение биологических свойств живых клеток в терапевтических целях1. В свою очередь, генотерапевтические лекарственные препараты (ГенЛП) — лекарственные препараты, фармацевтическая субстанция которых является рекомбинантной нуклеиновой кислотой или включает в себя рекомбинантную нуклеиновую кислоту, позволяющую осуществлять регулирование, репарацию, замену, добавление или удаление генетической последовательности2. Основные группы ГенЛП — это вирусные частицы, служащие генетическим вектором, ДНК-олигонуклеотиды и малые интерферирующие РНК, модулирующие экспрессию генов. В данном обзоре авторы осветили направление ГТ с использованием векторов на основе аденоассоциированных вирусов (adeno-associated viruses, AAV).

Несмотря на десятилетия развития данного вида ГТ для лечения наследственных заболеваний, широкому применению ГенЛП препятствует ряд объективных факторов. Одним из значимых факторов является исключительно высокая стоимость, несмотря на то что в большинстве случаев предполагается однократное применение ГенЛП. К другим ограничивающим факторам относятся барьеры биомедицинского характера, такие как небезопасность применения ГенЛП, связанная в первую очередь с иммуногенностью, ограничения полезной нагрузки в использующихся AAV векторах, недостаточная эффективность целевой доставки и экспрессии трансгена и др. В ряде случаев сопутствующие заболевания, история предшествующей терапии, возраст, упущенное или неоптимальное терапевтическое окно, существующая эффективная и безопасная стандартная терапия также препятствуют применению даже уже одобренного ГенЛП. Экспертная оценка регистрационного досье ГенЛП также представляет собой сложную задачу, особенно в условиях его неполной характеристики по сравнению с традиционными лекарственными средствами [1]. Наконец, технология производства ГенЛП на основе вирусных частиц характеризуется исключительно высокой себестоимостью в расчете на дозу. Данный обзор посвящен описанию этих барьеров и поиску путей их преодоления.

Цель работы — провести анализ применения генной терапии ряда наследственных заболеваний с учетом ограничений, связанных с побочными эффектами или недостаточной эффективностью генной терапии, проблемой определения терапевтического окна и индивидуальной спецификой наследственного заболевания, а также рассмотреть подходы для снятия этих ограничений и повышения доступности генной терапии путем усовершенствования технологических подходов производства и снижения себестоимости генотерапевтических препаратов.

В настоящее время зарегистрировано несколько ГенЛП для доставки экспрессионных конструкций in vivo, которые в большинстве являются препаратами для терапии наследственных заболеваний (табл. 1).

Для терапии гемофилии А применяется однократная инъекция препарата Роктавиан (валоктоген роксапарвовек). AAV вектор, применяемый в составе препарата, обеспечивает экспрессию функционального фактора свертываемости крови VIII-SQ (FVIII) в клетках печени. Однако следует отметить, что использование препарата ограничено рядом факторов. Во-первых, препарат не полностью исключил зависимость пациентов от инъекционных факторов свертываемости. Годовая частота кровотечений снизилась с 5,4 до 2,6 случая в год, а среднее число инфузий препаратов свертываемости — со 136 до 5. Время наблюдения после применения ГенЛП составило 3 года3, и пока неизвестно, насколько стабильной будет экспрессия FVIII в долгосрочной перспективе. Вполне вероятно, что может произойти падение уровня трансгенного FVIII и пациент снова будет зависимым от частых инфузий факторов свертываемости. Применение препарата Роктавиан, как и других AAV, имеющих тропизм к клеткам печени, не показано у детей, поскольку их печень еще растет. Также этой терапии не подлежат пациенты, имеющие антитела к серотипу AAV5, а также с хроническими заболеваниями печени, поскольку ГенЛП обладает выраженной гепатотоксичностью. Последнее является серьезным ограничивающем фактором, так как большинство пациентов гемофилией старше 20 лет в России страдают хроническим гепатитом С. Это связано с тем, что до 2005 г. больные гемофилией получали лечение компонентами крови, не проходившими вирусную инактивацию4. Практически все пациенты, получившие Роктавиан, были вынуждены пройти курс иммуносупрессивной терапии для предотвращения аутоиммунной реакции организма, вызванной введением AAV. Опрос участников клинического исследования (КИ) препарата Роктавиан выявил, что для некоторых иммуносупрессивная терапия, которую они получали во время участия в исследовании, либо в профилактических целях, либо для лечения трансаминита, была наименее переносимой частью исследования [2]. Существенная доля пациентов с гемофилией имеет ее ингибиторную форму, характеризующуюся высоким уровнем нейтрализующих антител, например к FVIII, что делает применение ГенЛП неэффективным. Такие пациенты переводятся на терапию препаратами шунтирующего действия (FVII, эмицизумаб), позволяющую запустить каскад свертывания крови в обход FVIII.

Гемофилия является примером, когда эффективная и безопасная ферментозаместительная терапия факторами свертываемости крови или препаратами шунтирующего действия позволяет контролировать болезнь и обеспечивать приемлемое качество жизни пациентов и в отсутствие ГТ. В данном случае ГТ должна доказать свою долгосрочную эффективность и безопасность, а главное, иметь стоимость существенно ниже, чем сейчас, чтобы стать стандартом лечения.

Другими примерами эффективной ферментозаместительной терапии, которая делает назначение ГТ по тому же показанию всего лишь одной из альтернатив, являются некоторые лизосомные болезни накопления (например, болезнь Гоше, Фабри и др.). Однако есть большое количество наследственных заболеваний, где ферментозаместительная терапия невозможна по определению и где только доставка функциональной копии гена в пораженные клетки (или иной способ коррекции мутации) может быть патогенетической терапией. К заболеваниям такого типа относится, например, миодистрофия Дюшенна (МДД).

Одной из серьезных проблем ГТ является недостаточная для восстановления нормального уровня экспрессии гена доза AAV, что связано с ограничением дозы по токсичности, или падение уровня экспрессии со временем. Последнее может иметь различные причины: рост целевой ткани (как отмечалось выше для печени), естественная гибель клеток, иммунный ответ организма, транскрипционный сайленсинг трансгена. Кроме этого, недостаточная эффективность и безопасность ГТ может иметь менее очевидные причины, что может быть проиллюстрировано на примере препарата Лукстурна.

Лукстурна (воретиген непарвовек) — первый ГенЛП, одобренный для лечения наследственной дегенерации сетчатки, вызванной биаллельными мутациями в гене RPE65. При проведении КИ, включая наблюдательные пострегистрационные, препарат продемонстрировал приемлемый профиль безопасности и эффективность, позволяя не только остановить прогрессию заболевания, но и во многих случаях даже частично восстановить уже утраченное зрение. Необходимо отметить, что период наблюдения самого масштабного к настоящему моменту пострегистрационного КИ (103 пациента) не превышал 2,3 года [3]. Эта ГТ проводится в виде субретинальной инъекции AAV, несущего функциональный ген RPE65. Ген RPE65 играет ключевую роль в обновлении 11-цис-ретиналя, необходимого для функционирования фоторецепторов сетчатки — палочек. Первичная терапевтическая мишень Лукстурна — клетки пигментного эпителия сетчатки, а фоторецепторы являются вторичной мишенью с точки зрения восстановления зрительной функции [4].

После одобрения препарата Лукстурна появились сообщения о хориоретинальной атрофии (ХРА) после применения ГТ, как вокруг места ретинотомии (места введения препарата), так и около крупных сосудов сетчатки. ХРА — это атрофия наружных слоев сетчатки, пигментного эпителия и хориокапиллярного слоя сосудистой оболочки сетчатки. Рост очагов ХРА наблюдался в течение нескольких месяцев, особенно у наиболее молодых пациентов, у которых изначально наблюдались наилучшие показатели эффективности ГТ. Степень прогрессии ХРА после введения препарата Лукстурна превышала естественное течение заболевания при сравнении с историческими морфологическими параметрами пациентов, не получавших данную ГТ. Были исключены несколько причин ХРА, такие как последствия хирургического вмешательства в процессе введения препарата или иммунный ответ и воспаление. Далее была выдвинута гипотеза, основанная на усилении метаболической активности сетчатки после «спасения» фоторецепторов с помощью ГТ [4].

Сетчатка в состоянии дегенерации имеет меньшую потребность в кислороде и меньше снабжается кислородом. Большинство случаев дегенерации сетчатки, включая опосредованные мутациями RPE65, сопровождается истощением ее сосудов. Если такое состояние пониженного метаболизма внезапно изменяется в результате вмешательства, приводящего к повышению функциональной активности фоторецепторов и, следовательно, всех клеток внутренней сетчатки, может ли дегенерировавшая система с низким содержанием кислорода справиться с этим после многих лет дегенерации? То, что случаи ХРА наблюдались преимущественно у молодых взрослых пациентов и подростков с высоким уровнем «спасения» палочек, может указывать на причинно-следственную связь эффективности и безопасности. Если это так, то функциональное восстановление дегенерированной ткани может привести к метаболическому и окислительному дисбалансу, что впоследствии приведет к гибели клеток [4]. Если эта гипотеза верна, то в худшем случае данная ГТ не просто не позволит сохранить зрение в течение взрослой жизни, но и после первых лет видимой эффективности приведет к ускоренной потере зрения по сравнению с нелечеными пациентами. Безусловно, это предположение требует большего времени наблюдательных КИ и большей выборки пациентов. Однако данный пример подчеркивает как опасность излишне упрощенного взгляда на ГТ, так и то, что восстановление функции дефектного гена должно рассматриваться с позиций системной биологии.

Большие ожидания направлены на ГТ наследственных заболеваний как на универсальный инструмент, позволяющий воздействовать на причину развития патологий. Критически важным для сохранения не только жизни, но и качества жизни пациентов является своевременное применение ГТ. Многие наследственные заболевания прогрессируют достаточно быстро и связаны с потерей функций, навыков, дисрегуляцией нормального клеточного и тканевого обмена, а также разрушением клеток и тканей, в норме экспрессирующих целевой белок. На поздних стадиях развития заболевания применение ГТ может оказаться неэффективным из-за необратимости изменений, произошедших в организме на фоне мутации и потери большей части клеток, являющихся мишенью терапии.

В связи с этим необходимо изучение естественного течения наследственного заболевания в каждом индивидуальном случае и определение «терапевтического временного окна» — наиболее благоприятного периода для лечения с восстановлением функций. В случае орфанных болезней изучение естественного течения осложняется небольшой выборкой и гетерогенностью пациентских групп, характерным для некоторых наследственных заболеваний разнообразием мутаций, влиянием на прогрессирование заболевания генов-модификаторов. Следует отметить, что определение оптимального возрастного периода для применения ГТ практически невозможно предсказать по результатам доклинических исследований. Последствия мутаций, которые вызывают развитие патологий, не всегда воспроизводятся на животных моделях соответствующих заболеваний. К тому же довольно сложно аппроксимировать возраст животных и возраст пациентов.

Возможности применения ГТ на ранних сроках развития патологии, а тем более на пресимптоматической стадии неразрывно связаны с возможностями диагностики заболевания. Единственный на сегодня препарат Элевидис (деландистроген моксепарвовек) для заместительной ГТ миодистрофии Дюшенна одобрен Управлением по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств США (Food and Drug Administration, FDA) по ускоренному механизму для введения амбулаторным пациентам в возрасте 4–5 лет15. При этом средний возраст (медиана) установления диагноза среди пациентов с МДД равен 4,9 (4,8) года [7], а от появления первых признаков заболевания до установления диагноза проходит в среднем 2,2 года. Позднее применение ГТ может стать не только неэффективным, но даже опасным для пациентов. Известно о смертельных случаях применения ГТ у пациентов с МДД на поздних стадиях развития заболевания (16 и 27 лет) в рамках КИ (NCT03362502, NCT05514249).

На примере препарата Золгенсма (онасемноген абепарвовек) для лечения спинальной мышечной атрофии на группе пациентов в пресимптоматической стадии заболевания была продемонстрирована феноменальная эффективность своевременно проведенной ГТ. У всех 14 пациентов после введения препарата определены показатели по шкалам оценки двигательного развития на уровне здоровых детей на протяжении 18 мес. наблюдения [6]. Таким образом, наиболее адекватной стратегией диагностики редких наследственных заболеваний с целью применения ГТ на пресимптоматической стадии является неонатальный скрининг [6]. Отдельно стоит упомянуть ультраорфанные наследственные заболевания (со встречаемостью менее 1 на 1 000 000 новорожденных), для которых предпринимаются попытки проведения пациент-специфической генной терапии.

Принимая во внимание временные затраты на диагностику, в том числе генетическую, для установления диагноза и связи обнаруженного фенотипа с ультраредкими мутациями в геноме, возможность разработки эффективной ГТ на современном этапе научно-технического развития является труднореализуемой. В связи с этим требуется создание платформенных решений, позволяющих в короткие сроки создавать и сканировать кандидатные препараты в пациент-специфических моделях и исследовать их безопасность [8].

Развитие тяжелых нежелательных явлений при применении ГенЛП на основе AAV часто ассоциировано с возникновением иммунного ответа на высокую дозу вирусного препарата или наличием у пациентов сопутствующих заболеваний [9]. В связи с этим существуют два направления по предотвращению возможных побочных эффектов: тщательный отбор пациентов и применение фармакотерапии для снижения потенциального иммунного ответа; модификация самого препарата для снижения дозы и удаления провоцирующих иммунитет факторов.

Пациентоориентированный подход

Считается, что AAV не патогенен для человека, тем не менее пациент может иметь историю контакта с природным серотипом AAV, в результате чего в его организме образуются иммунные клетки памяти. Учитывая быстрые и сильные иммунные реакции, которые индуцируются после формирования иммунологической памяти, необходимо идентифицировать и исключить лиц со сформированным адаптивным иммунитетом к конкретному серотипу AAV. Существующий иммунитет определяется путем выявления титров антител к определенному антигену, а пороговые значения титра используются как один из критериев отбора пациентов. Следует отметить, что среди разработчиков ГенЛП нет единого протокола определения предсуществующих антител. Варьируют как вид самого анализа, что приводит к выявлению разного типа антител (нейтрализующие, связывающие), так и пороговые значения [10]. Предельные значения титра антител часто определяются в доклинических исследованиях и после этого проверяются для клинического использования. Например, анализ трансдукции трансгена у макак-резус после изолированной перфузии конечностей AAVrh74.MCK.micro-dys.FLAG показал, что у животных с ранее существовавшими титрами антител к AAVrh74 >1:400 наблюдалась сниженная экспрессия трансгена по сравнению с животными с титрами антител к AAVrh74 ≤1:400 [10]. Эти доклинические исследования на приматах послужили основой для установления критериев отбора в последующих КИ. Разработка универсальных протоколов оценки пороговых значений позволила бы оптимизировать применение ГТ и, вероятно, расширила бы группы пациентов, для которых такая терапия применима.

Возможные иммунные реакции на рекомбинантные вирусные векторы не ограничиваются адаптивным гуморальным иммунитетом. В связи с разнообразием таких реакций введение AAV препаратов при ГТ проводят в сочетании с системными кортикостероидами. Например, кортикостероиды назначались всем пациентам, получившим препараты Лукстурна, Золгенсма и Элевидис в течение 7, 30 и 60 сут соответственно. При проведении ГТ при гемофилии (Гемгеникс, Роктавиан) иммуносупрессия кортикостероидами проводится при повышении трансаминаз. На фоне такой терапии возможны иммуноопосредованные побочные эффекты, к тому же назначение системных иммуносупрессантов само по себе также может вносить свой вклад в развитие нежелательных явлений. Многие исследовательские работы посвящены подбору более эффективной и безопасной фармакотерапии для снижения иммунного ответа на AAV препараты [11][12].

Подходы, направленные на модификацию препаратов

Для достижения эффективной трансдукции целевых клеток используется системное введение высоких доз рекомбинантных AAV вплоть до 1,33×10¹⁴ геномных копий на килограмм (гк/кг) в случае препарата Элевидис (табл. 1). Одновременно с трансдукцией целевых клеток вирусный капсид и терапевтический ген могут попадать в нецелевые ткани и органы, провоцируя развитие побочных реакций. Так, нежелательная трансдукция печени может вызывать разрушение гепатоцитов, что клинически выражается в повышении в сыворотке крови уровня трансаминаз (АЛТ, АСТ), наиболее частом побочном эффекте при системном введении препаратов на основе AAV. Гепатотоксичность стала причиной нескольких смертельных случаев применения ГТ на основе AAV в КИ у пациентов с Х-сцепленной миотубулярной миопатией и в наблюдательных пострегистрационных исследованиях у пациентов со спинальной мышечной атрофией [9]. В связи с этим в настоящее время проводятся исследования ГенЛП на основе AAV с модификацией капсидов и с введением генетических конструкций для увеличения трансдукции и уровня экспрессии в целевых клетках одновременно со снижением нецелевой доставки. В перспективе такая оптимизация может привести к уменьшению необходимой для достижения терапевтического эффекта дозы препаратов и снижению связанной с препаратом токсичности, а также потенциально может способствовать сокращению расходов на производство.

Модификация аминокислотной последовательности капсидных белков. Одобренные в настоящее время и находящиеся на продвинутых стадиях КИ препараты ГТ созданы с использованием капсидов природных серотипов AAV человека (2, 5, 9) и приматов (rh74) (табл. 1). Для усиления тропизма к целевым тканям и придания других функций на основе природных серотипов AAV создаются новые генно-инженерные капсиды. Успехи в этом направлении стали возможны благодаря определению трехмерной структуры капсидов AAV [13][15] и локализации позиций в капсидных белках для вставки экспонируемых пептидов, необходимых для процесса заражения клеток вирусом [15]. Например, положение после аминокислотного остатка Q588 в белке VP1, находящемся в вариабельном регионе VR-VIII капсида AAV9, было охарактеризовано как оптимальное для вставки экспонируемых пептидов для дальнейшей селекции модифицированных вариантов, обладающих повышенным тропизмом к мышечным клеткам. В работах двух исследовательских групп описаны варианты, эффективно трансдуцирующие клетки сердца, диафрагмы и скелетных мышц мышей и приматов: MyoAAV 2A и MyoAAV 4E [15] и AAVMYO [17]. При введении данных капсидов в дозах, на порядок меньших, чем стандартные, удавалось достичь уровня экспрессии трансгена, схожего с AAV9. Все лучшие выбранные варианты капсида включали трипептид Arg-Gly-Asp (RGD) в первых трех позициях встроенного семичленного пептида. Наиболее вероятным кандидатом для связывания RGD-пептида в мышцах является интегрин α7β1, который присутствует в изобилии во всех типах мышц, является рецептором ламинина и играет важную роль в развитии и функционировании мышечных клеток. Однако с антигенными свойствами RGD-пептида может быть связана потенциальная проблема. В связи с этим было высказано опасение о вероятной более высокой иммуногенности MYO модификаций AAV [18]. Иммуногенность полученных капсидов не изучалась экспериментально ни в одной из групп, использующих RGD-экспонирующие варианты AAV, однако в дальнейшем предстоит определить, не нивелирует ли повышенная иммуногенность капсидов с RGD-пептидом эффект, достигнутый снижением дозы.

В пилотных экспериментах на животных моделях заболеваний перечисленные выше и другие генно-инженерные капсиды были успешно использованы для коррекции фенотипа при МДД [16], Х-сцепленной миотубулярной миопатии [19], болезни Помпе [20]. В исследованиях продемонстрировано, что повышение тропизма капсидов к мышцам снижает неспецифическое заражение гепатоцитов, что может иметь положительный эффект при клиническом применении ГенЛП [16].

При модификации капсида AAV2 для увеличения тропизма к сердцу с использованием пептидов THGTPAD и NLPGSGD выявлено значительное повышение эффективности заражения кардиомиоцитов при снижении уровня трансдукции нецелевых тканей, а также более низкая иммуногенность данных серотипов на мышах [21]. В эксперименте in vivo этот капсид превосходил широко использующийся для доставки трансгенов в сердце AAV9 [21].

Направленная модификация капсидов AAV9 привела к созданию и новых нейротропных серотипов MDV1A и MDV1B, обеспечивающих эффективную доставку в нейроны на модели мышей, а также PAL-капсидов (proline arginine loop), показавших высокий уровень доставки в нейроны на модели приматов [22]. При этом капсиды, эффективные на мышах, не демонстрировали повышенного тропизма у приматов. PAL-серотипы обеспечивали небольшое достоверное увеличение экспрессии трансгена по сравнению с AAV9 при сниженной вирусной нагрузке в нецелевых органах, таких как печень, почки, легкие, тимус.

Следует отметить, что в перечисленных выше работах модификация капсидов для увеличения показателей трансдукции определенных типов клеток приводила также и к снижению уровня заражения нецелевых органов. Одновременно с этим предпринимаются направленные попытки точечных модификаций капсида с целью снижения уровня доставки (детаргетирования, detargeting) нецелевых органов, в первую очередь печени. В работе K. Adachi с соавт. [23] на основе данных проведенного скрининга мутантных капсидов AAV были обнаружены аминокислоты на поверхности AAV9, ответственные за трансдукцию тканей, в первую очередь печени. На основе этих данных были предложены новые варианты капсидов AAV, обладающих более низким накоплением в печени, например P504A/G505A-мутанты. При этом модификация снижала эффективность трансдукции и целевых органов, например сердца. Позже было продемонстрировано, что внесение упомянутых мутаций приводит к снижению уровня доставки в печень и в случае других созданных на основе AAV9 генно-инженерных капсидов. Серотип AAVMYO-LD (liver detargeting, LD) заметно хуже накапливался в печени мышей по сравнению с исходным серотипом AAVMYO, однако вместе с этим снизилась и эффективность трансдукции диафрагмы, сердца и скелетных мышц. Кроме того, внесение LD-мутаций привело к снижению эффективности продукции вирусов в отличие от исходной модификации [17].

С помощью изменения аминокислотной последовательности экспонируемых пептидов удалось добиться того, что предсуществующие антитела к природным серотипам AAV не узнают их модифицированные варианты. В работе J. Han с соавт. [24] с использованием подхода рационального дизайна получены мутанты с повышенной эффективностью трансдукции в сочетании со сниженной иммуногенностью. В качестве объекта исследования использовали капсиды AAV8 и AAVS3, обладающие естественным тропизмом к печени. Был проведен скрининг мутантов с измененным PLA-мотивом VP1/2, который участвует в высвобождении AAV из эндосом, и мутантов с изменениями последовательности аминокислот, подвергающихся N-гликозилированию. Полученные варианты обеспечивали более высокую эффективность трансдукции в клеточных линиях карциномы печени и первичных гепатоцитах, а также в других клеточных линиях тканей человека. Важно отметить, что все проверенные варианты показали меньшую чувствительность к нейтрализующим антителам in vitro и in vivo. Более того, профили антител после in vivo трансдукции модифицированными капсидами отличались от их родительских капсидов AAV [24].

Один из наиболее популярных подходов для модификации AAV основан на использовании N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Рецептор асиалогликопротеина (ASGP-R), высокоэкспрессируемый на поверхности гепатоцитов, представляет собой углеводсвязывающий белок, который распознает и связывает GalNAc или остатки галактозы. В работе M. Mével с соавт. [25] был разработан метод химической модификации AAV с помощью GalNAc и показано значительное увеличение трансдукции гепатоцитов in vitro по сравнению с немодифицированным AAV. При введении мышам модифицированного AAV наблюдалась индукция меньшего уровня антикапсидных антител по сравнению с природными векторами AAV2. Универсальный подход, основанный на биоконъюгации, представляет значительный интерес для регуляции иммунореактивности и тропизма капсида AAV [25]. В другом исследовании также использовался подход химической модификации реакционноспособных открытых остатков лизина. In vitro было показано, что капсид AAV9, модифицированный N-этилмалеимидом (NEM), усиливал экспрессию генов в культуре эндотелиальных клеток человека. In vivo при введении AAV9-NEM наблюдалось увеличение уровня трансдукции костного мозга и снижение трансдукции ткани печени по сравнению с немодифицированным AAV9 [26].

Для экранирования эпитопов AAV от нейтрализующих антител был предложен подход по созданию AAV, инкапсулированных во внеклеточные везикулы (EV-AAV). При использовании этого препарата для доставки генов в кардиомиоциты было продемонстрировано, что EV-AAV доставлял значительно больше геномных копий, чем немодифицированный AAV в присутствии нейтрализующих антител в левый желудочек человека, а также в кардиомиоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека in vitro и в сердце мыши in vivo. Эффективность такой системы доставки была продемонстрирована на мышиной модели инфаркта на фоне предварительной иммунизации AAV [27].

Следует отметить, что за последние несколько лет создание нового генно-инженерного капсида перестало быть трудозатратной и длительной задачей. Все больше разработчиков отдают предпочтение таким вариантам в надежде на более высокую эффективность и безопасность, а также патентную защиту своих разработок.

Модификация генома рекомбинантного ААV. Изменения генетической конструкции AAV могут быть внесены для увеличения уровня экспрессии, что в конечном счете может привести к снижению необходимой дозы препарата. Минимальными и достаточными элементами для контроля экспрессии трансгена являются промотор и сигнал полиаденилирования. Помимо них широко используются энхансеры, интроны и посттранскрипционные регуляторные элементы, которые в определенных комбинациях могут в разы увеличивать уровень экспрессии трансгена [28].

Эффективность генной терапии напрямую зависит от выбранного промотора, который контролирует экспрессию целевого гена. Сильные конститутивные промоторы небольшого размера способны обеспечивать высокие уровни экспрессии. Однако экспрессия, запускаемая ими в нецелевых клетках, способна вызвать активацию клеточных и гуморальных иммунных ответов на трансген. К тому же вирусные промоторы быстро метилируются во многих типах клеток, что приводит к снижению эффективности со временем. Для первых одобренных AAV препаратов было характерно использование конститутивных промоторов (Глибера, Лукстурна, Золгенсма), а в более поздних разработках уже применялись тканеспецифичные печеночные (Роктавиан, Гемгеникс) и мышечные (Элевидис) промоторы (табл. 1). Для увеличения специфичности экспрессии трансгенов создаются новые высокоэффективные тканеспецифичные промоторы [29].

В ряде исследований in vivo продемонстрировано возникновение иммунной толерантности к трансгену при небольшом уровне его экспрессии в печени [30]. В работе P. Colella с соавт. [31] предложен подход комбинирования различных тканеспецифичных промоторных элементов для экспрессии терапевтических трансгенов как в тканях-мишенях, так и в гепатоцитах. С этой целью использовали энхансер аполипопротеина E, элементы промотора антитрипсина альфа-1 человека и короткий синтетический промотор spC5.12, который активен как в сердечной, так и в скелетных мышцах и ранее успешно применялся на крупных животных моделях мышечной дистрофии. Авторы показали, что использование эффективных тандемных промоторов предотвращало формирование иммунных ответов на трансген после системной доставки гена кислой альфа-глюкозидазы (GAA) с помощью AAV у иммунокомпетентных мышей линии Gaa-/-. Также было продемонстрировано, что неонатальная генная терапия с помощью AAV8 или AAV9 у мышей Gaa-/- приводила к стойкому терапевтическому эффекту при использовании тандемного печеночно-мышечного промотора (LiMP), который обеспечивал высокую и стабильную экспрессию трансгена. Данный промотор использовали также для доставки трансгена в составе генно-инженерного капсида AAV-MT (muscle transduction). Эта комбинация капсида и промотора с улучшенной экспрессией в мышечных клетках и специфичностью позволила обеспечить повышение клиренса гликогена в сердечных и скелетных мышцах взрослых мышей линии Gaa-/-. У новорожденных Gaa-/- мышей полное восстановление содержания гликогена и мышечной силы наблюдалось через 6 мес. после инъекции AAV [32].

Помимо традиционных подходов, основанных на повышении специфичности трансдукции и транскрипции, микроРНК-зависимое посттранскрипционное подавление становится новой эффективной технологией для регулирования экспрессии трансгена [33][34]. МикроРНК представляют собой небольшие некодирующие РНК, чья экспрессия часто специфична для ткани или стадии дифференцировки. Обычно они регулируют экспрессию генов путем связывания с комплементарными последовательностями в 3'-нетранслируемой области (UTR) мРНК. Для контроля экзогенной экспрессии трансгена тандемные повторы искусственных сайтов-мишеней микроРНК (miR-BS) обычно включают в 3'-UTR область экспрессионной кассеты трансгена, что приводит к последующей деградации транскрипта в клетках, экспрессирующих соответствующую микроРНК. Многие подходящие микроРНК, избирательно представленные в отдельных тканях, уже определены. В частности, микроРНК-122 — микроРНК, почти исключительно экспрессируемая в ткани печени. В нескольких исследованиях было показано успешное подавление экспрессии трансгена в печени, опосредованное микроРНК-122 [33]. Однако специфической экспрессии микроРНК может быть недостаточно для достижения сильного микроРНК-зависимого подавления экспрессии трансгена.

Важным звеном при формировании иммунного ответа являются антигенпрезентирующие клетки. С целью снижения трансген-специфических иммунных ответов и разработки безопасных генетических конструкций в результате in vitro скрининга был подобрана комбинация микроРНК-142BS и микроРНК-652-5pBS, которая значительно подавляла экспрессию трансгена в антигенпрезентирующих клетках, но сохраняла высокий уровень его экспрессии в мышечных клетках. При внутримышечной доставке препаратов AAV1 c элементами микроРНК-142/652-5pBS были достигнуты более высокие уровни экспрессии трансгена, чем предыдущие конструкции, а также выявлено эффективное ингибирование активации цитотоксических Т-лимфоцитов и Th17 [35].

Для регулируемой экспрессии трансгена также предложен подход на основе РНК-интерференции. В работе M. Subramanian с соавт. [36] разработана конструкция, одновременно содержащая как короткую шпилечную РНК, так и сайты ее связывания. Для индукции трансгена использовали технологию REVERSIR — синтетический высокоаффинный олигонуклеотид, комплементарный направляющей цепи короткой шпилечной РНК, позволяющий подавить РНК-интерференцию и быстро восстановить экспрессию трансгена. Полученные результаты создают концептуальную основу для регулируемых переключателей на основе РНК-интерференции и динамической модуляции экспрессии генной терапии с возможностью снижения частоты дозирования в клинических условиях [36]. Для достижения регулируемой экспрессии трансгена были апробированы и тетрациклин-зависимые промоторные элементы. Так, репортерная система на основе AAV1 была использована для оценки длительности экспрессии трансгена в ответ на доксициклин. Авторы продемонстрировали, что экспрессия целевого белка сохраняется вплоть до 5 лет после введения [37].

В работе X. Wu с соавт. [38] была предложена трансгенная система, индуцируемая мусконом (AAVMUSE), на основе мышиного обонятельного рецептора, связанного с G-белком (MOR215-1), и синтетического промотора, реагирующего на цАМФ. При воздействии триггера мускон связывается с MOR215-1 и активирует сигнальный путь цАМФ, инициируя экспрессию трансгена. Применение AAVMUSE обеспечивало зависимый от дозы и времени воздействия мускона контроль экспрессии люциферазы в печени или легких мышей в течение как минимум 20 нед. Была продемонстрирована эффективность системы AAVMUSE для коррекции фенотипа на моделях мышей с хроническими воспалительными заболеваниями: неалкогольная жировая болезнь печени и аллергическая астма [38].

Активация адаптивного иммунитета возможна посредством распознавания гипометилированных CpG мотивов доставленной генетической конструкции рецептором TLR9 (toll-like receptor 9), что в дальнейшем запускает образование цитотоксических Т-лимфоцитов. Повышение содержания CpG-мотивов часто достигается за счет оптимизации конструкций, например оптимизации кодонов. В доклинических и клинических исследованиях ГенЛП продемонстрирована зависимость развития цитотоксической иммунной реакции от содержания в препарате CpG-мотивов, которая, в свою очередь, приводила к быстрой потере трансгена [39][40]. В работе J.F. Wright с соавт. [41] предложена методика количественной оценки потенциала генетической конструкции к активации TLR9 на основе содержания CpG-мотивов. Показано, что терапевтические AAV, близкие по содержанию CpG-мотивов к человеческому геному, наиболее безопасны для клинического применения. Помимо снижения содержания CpG-мотивов предложен вариант использования ДНК последовательностей, блокирующих TLR9 рецепторы [42].

В настоящее время AAV являются золотым стандартом для препаратов генной терапии. С момента регистрации первого препарата ГенЛП Глибера (2012, EMA)16 технология производства претерпела значительное усовершенствование. Основными драйверами модернизации являются ограниченные производственные мощности при текущей низкой производительности процесса, которые не в состоянии обеспечить постоянно растущие потребности в препаратах, и высокая стоимость курса терапии.

Транзиторная трансфекция плазмидной ДНК клеточной линии HEK-293 остается наиболее распространенным методом производства AAV. Обычно для трансфекции используются три плазмиды, первая из которых несет терапевтический ген интереса (gene of interest, GoI), вторая — гены капсида AAV и репликации (rep/cap) и третья хелперная — дополнительные гены аденовируса, необходимые для репликации AAV внутри клетки-хозяина HEK-293.

Первая технология производства представляла собой культивирование клеток, прикрепленных к стенке сосуда (адгезионная культура), с использованием среды, содержащей фетальную сыворотку крупного рогатого скота [43][44]. По аналогии с эволюцией технологии производства моноклональных антител (мАТ) такая технология трудно масштабируема из-за невозможности культивирования большого количества культуральных флаконов, роллерных бутылей, флаконов типа CellStack и др. [45][46]. Первым шагом к масштабированию технологии культивирования стало появление биореакторов с неподвижным слоем микроносителей iCELLis™ (Pall), в которых площадь поверхности культуры в одном сосуде достигала 500 м² (эквивалентно 3000 роллерных флаконов площадью 1700 см²), обеспечивая при этом некоторую степень контроля процесса за счет поддержания достаточного газообмена, питательных веществ, а также уменьшения накопления метаболитов клеточной культуры, таких как аммиак и молочная кислота [47].

Тем не менее эти системы ограничены по площади поверхности, плотности клеток, которую можно достичь, и в конечном счете требуют дополнительного масштабирования для удовлетворения потребности в препаратах. Указанные ограничения, а также проблема использования компонентов животного происхождения способствовали дальнейшему совершенствованию технологии, что привело к появлению питательных сред для суспензионных культур клеток HEK-293 и позволило масштабировать технологию культивирования от настольных систем до биореакторов с осевым перемешиванием индустриального масштаба (до 2000 л) [48].

Параллельно с усовершенствованием технологии культивирования за прошедшее десятилетие в производстве ГенЛП произошли значительные изменения и в стадии очистки вирусных частиц. Можно выделить следующие основные тенденции: повышение доли содержания полных частиц за счет удаления как пустых капсидов, так и частично заполненных; более эффективная очистка от примесей (остаточная РНК и ДНК), связанных с процессом производства; повышение эффективности очистки для снижения производственных затрат. Одним из существенных достижений за последние годы стало появление аффинных сорбентов, позволяющих эффективно выделять вирусные частицы из клеточного лизата, в котором вирусные частицы являются минорным компонентом [49]. Более того, появились новые типы хроматографических сред, такие как монолитные или мембранные сорбенты, которые могут обеспечить более высокую производительность по сравнению с традиционными смолами. Одним из примеров является подход к разделению фаз системы жидкость-жидкость, основанный на связывании гидрофобного аффинного сорбента с вирусными частицами в клеточном лизате. Это сочетается с тангенциальной фильтрацией потока для получения очищенного материала [50]. Другим примером является одноразовая проточная система, в которой в рециркуляционном протоке используется хроматографическая смола. В этой системе различные технологические буферы смешиваются и могут циркулировать в потоке вместе с исходным лизатом. При их применении в оптимальной последовательности очищенный материал элюируется в отдельную емкость [51].

Разделение пустых и полных капсидов также является одним из направлений в очистке AAV, в котором достигнуты определенные успехи. В начале развития технологии единственным методом являлось ультрацентрифугирование в градиенте плотности CsCl или йодиксанола [52][53], однако этот способ трудномасштабируемый и вызывает сложности с точки зрения требований GMP. Сложности с развитием хроматографических методов были связаны с тем, что разделение различных форм AAV возможно только по заряду, однако значения изоэлектрической точки у пустых, заполненных и частично заполненных крайне близки. Тем не менее за последние годы в этом направлении достигнут прогресс [53]. В частности, в совместном исследовании АО «ГЕНЕРИУМ» и ООО «Марлин Биотех» по разработке ГенЛП на основе AAV удалось оптимизировать технологию очистки на основе анионообменной хроматографии, позволяющую производить препарат с 90% содержанием заполненных AAV. После этой стадии остается только один раунд препаративного центрифугирования, в гораздо меньшем масштабе, для того чтобы добиться чистоты, установленной разработчиком, в целевом профиле качества продукта. Предложенный подход значительно повышает возможности масштабирования и воспроизводимости процесса, а также отвечает всем современным требованиям GMP.

Несмотря на достигнутые успехи в области производства AAV, нерешенной проблемой по-прежнему остается высокая себестоимость производства, а следовательно, ограниченная доступность терапии для пациентов вследствие ее стоимости. Текущие усилия разработчиков направлены на повышение исходного титра AAV в процессе культивирования. В настоящее время можно выделить несколько основных трендов: совершенствование трехплазмидной технологии; использование модифицированного хелперного аденовируса; получение клеточной линии, в геном которой интегрированы гены для экспрессии AAV (для отхода от трансфекции клеток в каждом цикле производства).

Совершенствование плазмидной технологии заключается в поиске эффективных трансфекционных агентов, культуральных сред и подпиток, подборе клона родительской клеточной линии HEK-293 и оптимизации генетических конструкций плазмид pRepCap и pHelper. Примером такой технологии является платформа Xcite®AAV (Lonza). Согласно данным разработчиков платформа позволяет добиться повышения титра AAV в 2–8 раз в сравнении с коммерчески доступными плазмидами и клеточной линией17.

Вирусная трансдукция в качестве доставки генетического материала в клетку более эффективна и экономична, чем трансфекция плазмидами. Однако наличие дополнительного вирусного агента в производстве является нежелательным по соображениям безопасности. Исходя из того что жизненный цикл аденовируса состоит из двух фаз: ранней и поздней, разработчики технологии TESSA™ (OXGENE Ltd) сконструировали модифицированные рекомбинантные хелперные аденовирусы, у которых происходит самоингибирование главного позднего промотора (MLP), обеспечивая тем самым блокировку собственной репликации. Вставка сайта связывания репрессора тетрациклина (TetR) делает возможной нормальную репликацию вируса только в присутствии доксициклина, в отсутствие же доксициклина происходит только амплификация генома и экспрессия ранних генов хелперных функций. На первом этапе производства получают два хелперных аденовируса (один из которых кодирует гены rep и cap AAV, а второй — целевой ген AAV) в присутствии доксициклина. На втором этапе путем совместной инфекции клеток HEK-293 двумя хелперными аденовирусами в отсутствие доксициклина происходит наработка только AAV [55]. Важным преимуществом данной технологии является отсутствие необходимости производства большого количества плазмид. По данным разработчиков продуктивность технологии примерно в 30 раз выше, чем подхода на основе плазмид. Из недостатков можно отметить необходимость очистки финального продукта от хелперных аденовирусов.

Создание стабильных клеточных линий, продуцирующих AAV по аналогии с производством мАТ, является перспективным подходом для повышения продуктивности. Существенное техническое ограничение этого подхода – токсичность вирусных генов для самой экспрессионной системы. Разработчики платформы ELEVECTA™ (Cytiva) создали индуцибельные клеточные линии-продуценты AAV, основанные на использовании клеток HEK-293, в геном которых стабильно интегрированы хелперные гены аденовируса (E2A, E4orf6 и VA РНК), а токсичный ген rep AAV индуцируется добавлением доксициклина (система индукции Tet-on). Интеграция гена rep в геном стала возможной благодаря инактивации промотора p19 при сохранении функциональности Rep78/68. Далее для получения финального стабильного продуцента AAV проводится трансфекция этой клеточной линии конструкцией с желаемой серотип-специфической cap-последовательностью, а также последовательностью гена интереса. Согласно данным разработчиков продуктивность перфузионного процесса на этой платформе составляет 10¹⁵ г/л с содержанием 30% заполненных капсидов [56]. Перспективные платформы биосинтеза AAV в сравнении с традиционной трехплазмидной технологией обобщены в таблице 2 (опубликована на сайте журнала18).

Таким образом, технология производства AAV является относительно молодым направлением, проходящим все традиционные этапы развития биотехнологического производства рекомбинантных продуктов. В данном контексте уместна аналогия с эволюцией технологии производства мАТ. Технология производства AAV уже претерпела значительные изменения и продолжает совершенствоваться. Получившая наибольшее распространение плазмидная технология является стандартом в настоящее время, но уже заметен тренд на замещение ее новыми подходами с использованием рекомбинантных хелперных вирусов и стабильных клеточных линий. Кроме того, постоянно появляются новые среды, подпитки, сорбенты, фильтры и другое сырье. Возрастающая потребность в препаратах на основе AAV будет и в дальнейшем стимулировать совершенствование технологии, повышение продуктивности и снижение себестоимости, что в конечном счете будет способствовать большей доступности препаратов этого класса.

Проведенный анализ применения генной терапии наследственных заболеваний позволил выявить ряд барьеров биомедицинского и технологического характера, преодоление которых необходимо для дальнейшего развития данного направления. Для того чтобы сделать применение генной терапии оправданным с медицинской точки зрения и повысить ее доступность для пациентов, необходимо решить комплекс проблем, а именно:

Пути решения данных проблем должны быть определены как на доклинической стадии разработки, так и после первой демонстрации клинической эффективности генотерапевтических препаратов. Без системного решения этих проблем генная терапия на основе вирусных векторов не сможет войти в стандарты лечения не только по причине высокой финансовой нагрузки на здравоохранение, но и по причине ограниченной эффективности.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Все авторы участвовали в разработке концепции обзора, написании текста рукописи, формулировке выводов.

Благодарности. Авторы благодарны В.В. Батрак и Р.А. Хамитову за обсуждение концепции обзора.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. All the authors participated in the development of the concept of this review, drafted the manuscript, and formulated the conclusions.

Acknowledgements. The authors are grateful to V.V. Batrak and R.A. Khamitov for discussing the review concept.

1. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs). Guidance for industry. 2008-D-0205. FDA; 2020. 2. Федеральный закон Российской Федерации от 12.04.2010 № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств». 3. https://www.roctavian.com/en-us/roctavian-results/ 4. https://medvestnik.ru/content/news/Bolee-90-bolnyh-gemofiliei-starshe-18-let-stradaut-hronicheskim-gepatitom-S.html 5. https://www.globaldata.com/ 6. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment-report_en.pdf 7. https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/luxturna 8. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/zolgensma-epar-public-assessment-report_en.pdf 9. https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/tissue-tissue-products/elevidys 10. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/roctavian-epar-public-assessment-report_en.pdf 11. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/hemgenix-epar-public-assessment-report_en.pdf 12. https://www.fda.gov/media/169435/download 13. https://neovasculgen.info/instruktsiya-po-primeneniyu 14. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/upstaza-epar-public-assessment-report_en.pdf 15. https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/tissue-tissue-products/elevidys 16. https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/glybera 17. https://www.lonza.com/knowledge-center/cellgene/brief/AAV-production-HEK293-cell-line 18. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-2-123-139-table2