Научный сотрудник отдела молекулярной и клеточной биологии
1st professional category expert of the Laboratory of Molecular Biology and Genetic Test Methods of the Testing Centre for Evaluation of Medicinal Immunobiological Products’ Quality. Candidate of Biological Sciences
Эксперт 2-ой категории лаборатории молекулярно-биологических и генетических методов испытаний Испытательного центра экспертизы качества МИБП
2nd professional category expert of the Laboratory of Molecular Biology and Genetic Test Methods of the Testing Centre for Evaluation of Medicinal Immunobiological Products’ Quality
Главный эксперт лаборатории молекулярно-биологических и генетических методов испытаний Испытательного центра экспертизы качества МИБП, канд. биол наук
Chief expert of the Laboratory of Molecular Biology and Genetic Test Methods of the Testing Centre for Evaluation of Medicinal Immunobiological Products’ Quality. Candidate of Biological Sciences
Начальник лаборатории молекулярно-биологических и генетических методов испытаний Испытательного центра экспертизы качества МИБП, д-р биол. наук
Head of the Laboratory of Molecular Biology and Genetic Test Methods of the Testing Centre for Evaluation of Medicinal Immunobiological Products’ Quality. Doctor of Biological Sciences
При испытании биологических лекарственных средств по показателям «Подлинность», «Чистота», «Молекулярная масса» проводят сравнительную оценку исследуемого и стандартного образцов различными физико-химическими методами, в том числе методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS) в восстанавливающих/невосстанавливающих условиях. Для оценки молекулярной массы компонентов стандартного и исследуемого образцов необходимо построение калибровочного графика с использованием белков-маркеров. Проведено 4 эксперимента по электрофоретическому разделению на одном геле наиболее часто используемых наборов маркеров молекулярных масс различных производителей (Amersham™ LMW Calibration Kit for SDS Electrophoresis (Am), SDS PAGE Molecular Weight Standards, low range (BR), Unstained Protein Molecular Weight Marker (Th), BenchMark™ Protein Ladder (BM), Mark12™ Unstained Standard (M12) (общее количество белков - 45). Работа выполнена с целью оптимизации способов математической обработки калибровочных кривых для указанных наборов и оценки возможности их взаимозаменяемости. Электрофорез в ПААГ с SDS проводили в восстанавливающих условиях с использованием трис-глициновых заливных гелей. Для сравнения рассчитываемых ( М ) и номинальных ( М0) (указанных в инструкции по применению набора маркеров) значений молекулярной массы (ММ) белков-маркеров нами использовано отклонение ММ в пересчете на единицу молекулярной массы (далее - относительное отклонение). Оценка среднего относительного отклонения молекулярной массы маркеров наборов диапазона ММ 10-100 кДа (наборы Am, BR, Th) при использовании уравнений линейной регрессии показала значения около 10 % (от 8,3 до 12,0 %). Для наборов расширенного диапазона ММ 10-220 кДа (наборы BM, M12) среднее относительное отклонение (16,5-20,3 %) было практически вдвое больше. С целью оптимизации математической обработки для расчета калибровочной зависимости мы применили полиномиальное уравнение регрессии третьей степени. Это позволило снизить относительное отклонение ММ до 2,3-3,5 % при использовании наборов диапазона 10-100 кДа и до 3,7-4,0 % при использовании наборов расширенного диапазона, что важно при оценке сопоставимости различных продуктов.
Identification and purity testing of biologicals as well as determination of their molecular mass are performed on the basis of comparison of test and reference samples by various physico-chemical methods, including Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing or non-reducing conditions. In order to assess the molecular weight of the test sample and reference sample components a calibration curve is drawn using protein markers. The article describes 4 experiments in which gel electrophoresis was used for separation of the most widely used sets of molecular weight markers produced by various manufacturers (Amersham™ LMW Calibration Kit for SDS Electrophoresis (Am), SDS PAGE Molecular Weight Standards, low range (BR), Unstained Protein Molecular Weight Marker (Th), BenchMark™ Protein Ladder (BM), Mark12™ Unstained Standard(M12) (total number of proteins - 45)). The aim of the study was to optimize mathematical processing of calibration curves generated for the above-mentioned sets of markers and to assess their interchangeability. SDS PAGE was performed under reducing conditions using Tris-Glycine gels. The real calculated ( M ) and nominal ( M0) values (indicated in the set of markers instructions for use) of the protein markers molecular mass (MM) were compared using the MM deviation expressed in terms of a molecular mass unit (hereinafter - relative deviation). The estimated average MM relative deviation for sets of markers ranging from 10 to 100 kDa (Am, BR, Th sets), which was calculated using linear regression equations, was equal to about 10 % (8.3 - 12.0 %). In the case of the extended MM range of 10 - 220 kDa (BM, M12 sets) the average relative deviation was almost twice as high (16.5 - 20.3 %). A third-order polynomial regression equation was used to optimize mathematical processing methods used during calculation of the calibration function. This made it possible to reduce the MM relative deviation down to 2.3 - 3.5 % when using sets ranging from 10 to 100 kDa, and to 3.7 - 4.0 % when using the extended range sets, which is important for assessing similarity of different products.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.