biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2026-26-1-85-96biopreparat-738Research ArticleТема номера: ИННОВАЦИОННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ: ОТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ К РЕАЛЬНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕIssue topic INNOVATIVE BIOLOGICAL PRODUCTS: TRANSLATING FUNDAMENTAL RESEARCH INTO REAL CLINICAL PRACTICEОценка активности филграстима биологическим методом in vitro: валидация методикиValidation of an in vitro biological method for filgrastim potency assessmenthttps://orcid.org/0000-0002-6176-5934ГайдероваЛ. А.GaiderovaL. A.

Гайдерова Лидия Александровна, канд. мед. наук 

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Lidia A. Gaiderova, Cand. Sci. (Med.) 

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

gaiderova@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9889-4038БайковаМ. Л.BaykovaM. L.

Байкова Марина Леонидовна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Marina L. Baykova

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

baikova@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6966-9859ГоловинскаяО. В.GolovinskayaO. V.

Головинская Ольга Вячеславовна, канд. мед. наук 

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Olga V. Golovinskaya, Cand. Sci. (Med.) 

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

golovinskaya@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7864-8972ЛысиковаС. Л.LysikovaS. L.

Лысикова Светлана Леонидовна, канд. мед. наук 

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Svetlana L. Lysikova, Cand. Sci. (Med.) 

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

lisikova@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8677-0927ФоменкоВ. В.FomenkoV. V.

Фоменко Виктория Валерьевна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Viktoriia V. Fomenko

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

fomenkovv@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6807-508XАлпатоваН. А.AlpatovaN. A.

Алпатова Наталья Александровна, д-р биол. наук 

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Natalia А. Alpatova, Dr. Sci. (Biol.) 

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

alpatova@expmed.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияScientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsRussian Federation2026010420262618596Copyright © Гайдерова Л.А., Байкова М.Л., Головинская О.В., Лысикова С.Л., Фоменко В.В., Алпатова Н.А., 20262026Гайдерова Л.А., Байкова М.Л., Головинская О.В., Лысикова С.Л., Фоменко В.В., Алпатова Н.А.Gaiderova L.A., Baykova M.L., Golovinskaya O.V., Lysikova S.L., Fomenko V.V., Alpatova N.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/738ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. Филграстим представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека, изготовленный по технологии рекомбинантных ДНК. Поскольку при производственном контроле качества филграстима должна применяться валидированная методика, первостепенное значение имеет установление ее валидационных характеристик методики в полном объеме, а при замене критичных реагентов/материалов/параметров — подтверждение ранее установленных.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Выбор параметров и подтверждение ряда валидационных характеристик методики оценки специфической активности филграстима биологическим методом in vitro при использовании клеточной линии NFS-60.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Специфическую активность филграстима оценивали по интенсивности флуоресценции красителя аlamarBlue™ при длинах волн возбуждения (530 нм) и эмиссии (620 нм), прямо пропорциональной уровню пролиферации клеток линии NFS-60 под действием филграстима в дозах от 0,1 до 208 МЕ/мл. Полученные данные анализировали в программе PLA 2.0.0 методом параллельных линий с использованием 4-параметрической логистической функции 4PL.

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Методика охарактеризована как прецизионная: значение коэффициента вариации (CV) при изучении повторяемости и внутрилабораторной прецизионности составляет 6,20 и 1,19% соответственно (критерий приемлемости CV≤25%). Методика линейна — коэффициент детерминации (R2) линейной функции составляет 0,99 при значении   критерия   приемлемости   R2≥0,95.   Значение   степени   извлечения   составляет   101,6% и не превышает отклонения ±10% от ожидаемого значения. Методика устойчива к увеличению плотности клеточной суспензии с 1,5×105 до 3,0×105 клеток/мл (CV=0,07%) и увеличению продолжительности инкубации образцов филграстима с клеточной суспензией с 48 до 72 ч (CV=4,2%) или с флуоресцентным красителем с 4 до 6 ч (CV=2,05%).

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Методика оценки специфической активности препаратов на основе филграстима   в   условиях   in   vitro   при   использовании   клеток   линии   NFS-60   характеризуется линейностью, прецизионностью и   правильностью;   показана   устойчивость   методики при контролируемом изменении ряда параметров. Исследование подтверждает пригодность использования клеток линии NFS-60 при оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима. Это имеет важное значение для производителей с точки зрения расширения спектра клеточных линий, применяемых при оценке качества препаратов.

INTRODUCTION

INTRODUCTION. Filgrastim is a human granulocyte colony-stimulating factor produced using recombinant DNA technology. Since filgrastim quality control necessitates a validated method, establishing the entire method validation parameters is of high priority; confirming the previously established parameters gains primary importance when substituting critical reagents/ materials/parameters.

AIM

AIM. This study aimed to select and confirm a number of validation parameters for in vitro biological method that would assess filgrastim potency using NFS-60 cell line.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. Filgrastim potency was assessed by fluorescence intensity of alamarBlue™ reagent at excitation wavelengths of 530 nm and emission of 620 nm directly proportional to proliferation level of NFS-60 cells exposed to filgrastim 0.1 to 208 IU/mL. Statistical analysis of the results was performed using the 4-parameter logistic function 4PL and the parallel line analysis in PLA 2.0.0 software.

RESULTS

RESULTS. The method was deemed precise: the coefficient of variation (CV) in the repeatability study was 6.20%, and the intermediate precision study showed CV 1.19% (acceptance criterion CV≤25%). The method was linear; the coefficient of determination for the linear function was R2=0.99 (acceptance criterion R2≥0.95). The degree of recovery was 101.6% and did not exceed ±10% of the expected value. The method was robust to an increased density of the cell suspension from 1.5×105 to 3.0×105 cells/mL (CV=0.07%) and to prolonged incubation of filgrastim samples with the cell suspension (from 48 to 72 h, CV=4.2%) or with fluorescent dye (from 4 to 6 h, CV=2.05%).

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. The in vitro method assessing specific potency of filgrastim-based preparations using NFS-60 cell line is linear, precise, and accurate, and has proven to be stable under controlled changes of certain parameters. Confirmed applicability of NFS-60 cell line for assessing the potency of filgrastim-based preparations is essential for manufacturers, since it expands the range of cell cultures used for quality assessment of preparations.

специфическая активностьбиологический методвалидационные характеристикиправильностьлинейностьробастностьпрецизионностьлиния клеток NFS-60гранулоцитарный колониестимулирующий факторspecific activitybiological methodvalidation parameterscorrectnesslinearityrobustnessprecisionNFS-60 cell linegranulocyte colony-stimulating factorРабота выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00061-26-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 124022200103-5).The study was conducted by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products as part of the applied research funded under State Assignment No. 056-00061-26-00 (R&D Registry No. 124022200103-5)ReferencesTrinh NTM, Thuoc TL, Thao DTP. Production of recombinant human G-CSF from non-classical inclusion bodies in Escherichia coli. Braz J Microbiol. 2021;52(2):541–6. https://doi.org/10.1007/s42770-020-00413-yTrinh NTM, Thuoc TL, Thao DTP. Production of recombinant human G-CSF from non-classical inclusion bodies in Escherichia coli. Braz J Microbiol. 2021;52(2):541–6. https://doi.org/10.1007/s42770-020-00413-yBond TC, Szabo E, Gabriel S, et al. Meta-analysis and indirect treatment comparison of lipegfilgrastim with pegfilgrastim and filgrastim for the reduction of chemotherapyinduced neutropenia-related events. J Oncol Pharm Pract. 2018;24(6):412–23. https://doi.org/10.1177/1078155217714859Bond TC, Szabo E, Gabriel S, et al. Meta-analysis and indirect treatment comparison of lipegfilgrastim with pegfilgrastim and filgrastim for the reduction of chemotherapyinduced neutropenia-related events. J Oncol Pharm Pract. 2018;24(6):412–23. https://doi.org/10.1177/1078155217714859Cornes P, Gascon P, Chan St, et al. Systematic review and meta-analysis of short-versus long-acting granulocyte colony-stimulating factors for reduction of chemotherapy-induced febrile neutropenia. Adv Ther. 2018;35(11):1816–29. https://doi.org/10.1007/s12325-018-0798-6Cornes P, Gascon P, Chan St, et al. Systematic review and meta-analysis of short-versus long-acting granulocyte colony-stimulating factors for reduction of chemotherapy-induced febrile neutropenia. Adv Ther. 2018;35(11):1816–29. https://doi.org/10.1007/s12325-018-0798-6Levy MJ, Gucinski AC, Sommers CD, et al. Analytical techniques and bioactivity assays to compare the structure and function of filgrastim (granulocyte-colony stimulating factor) therapeutics from different manufacturers. Anal Bioanal Chem. 2014;406(26):6559–67. https://doi.org/10.1007/s00216-013-7469-xLevy MJ, Gucinski AC, Sommers CD, et al. Analytical techniques and bioactivity assays to compare the structure and function of filgrastim (granulocyte-colony stimulating factor) therapeutics from different manufacturers. Anal Bioanal Chem. 2014;406(26):6559–67. https://doi.org/10.1007/s00216-013-7469-xMagalhaes V, Mantovani M, Caruso C, et al. Physicochemical and biological comparison of the first Brazilian biosimilar filgrastim with its reference product. Biosimilars. 2016;6:45–60. https://doi.org/10.2147/BS.S107898Magalhaes V, Mantovani M, Caruso C, et al. Physicochemical and biological comparison of the first Brazilian biosimilar filgrastim with its reference product. Biosimilars. 2016;6:45–60. https://doi.org/10.2147/BS.S107898Caselli D, Cesaro S, Aricò M. Biosimilars in the management of neutropenia: Focus on filgrastim. Biologics. 2016;10:17–22. https://doi.org/10.2147/BTT.S73580Caselli D, Cesaro S, Aricò M. Biosimilars in the management of neutropenia: Focus on filgrastim. Biologics. 2016;10:17–22. https://doi.org/10.2147/BTT.S73580Авдеева ЖИ, Солдатов АА, Алпатова НА и др. Биоаналоговые (биоподобные) лекарственные препараты рекомбинантного гранулоцитарного-колониестимулирующего фактора. Оценка качества. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015;(1):4–14. EDN: UBEKFJAvdeeva ZhI, Soldatov AA, Alpatova NA, et al. Recombinant granulocyte colony stimulating factor biosimilars. Quality assessment. BIOpreparation. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2015;(1):4–14 (In Russ.). EDN: UBEKFJWhite JR, Abodeely M, Ahmed S, et al. Best practices in bioassay development to support registration of biopharmaceuticals. Biotechniques. 2019;67(3):126–37. https://doi.org/10.2144/btn-2019-0031White JR, Abodeely M, Ahmed S, et al. Best practices in bioassay development to support registration of biopharmaceuticals. Biotechniques. 2019;67(3):126–37. https://doi.org/10.2144/btn-2019-0031Li H, Witkos TM, Umlauf S, Thompson C. Potency assay variability estimation in practice. Pharm Stat. 2025;24(1):e2408. https://doi.org/10.1002/pst.2408Li H, Witkos TM, Umlauf S, Thompson C. Potency assay variability estimation in practice. Pharm Stat. 2025;24(1):e2408. https://doi.org/10.1002/pst.2408Präbst K, Engelhardt H, Ringgeler S, Hübner H. Basic сolorimetric proliferation assays: MTT, WST, and Resazurin. Methods Mol Biol. 2017;1601:1–17. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6960-9_1Präbst K, Engelhardt H, Ringgeler S, Hübner H. Basic сolorimetric proliferation assays: MTT, WST, and Resazurin. Methods Mol Biol. 2017;1601:1–17. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6960-9_1Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(6):10. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095505Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(6):10. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095505Tiwari K, Wavdhane M, Haque S, et al. A sensitive WST8-based bioassay for PEGylated granulocyte colony stimulating factor using the NFS-60 cell line. Pharm Biol. 2015;53(6):849–54. https://doi.org/10.3109/13880209.2014.943248Tiwari K, Wavdhane M, Haque S, et al. A sensitive WST8-based bioassay for PEGylated granulocyte colony stimulating factor using the NFS-60 cell line. Pharm Biol. 2015;53(6):849–54. https://doi.org/10.3109/13880209.2014.943248Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the alamarBlue assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(6):10. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095489Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the alamarBlue assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(6):10. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095489Головинская ОВ, Байкова МЛ, Алпатова НА и др. Сравнительный анализ красителей, используемых при оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима биологическим методом in vitro. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020,20(3):193–201. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-3-193-201Golovinskaya OV, Baykova ML, Alpatova NA, et al. Comparative analysis of dyes used in the assessment of filgrastim products specific activity by biological in vitro methods. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2020;20(3):193–201 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-3-193-201Nakoinz I, Lee MT, Weaver JF, Ralph P. Differentiation of the IL-3-dependent NFS-60 cell line and adaption to growth in macrophage colony-stimulating factor. J Immunol. 1990;145(3):860–4. PMID: 2142710Nakoinz I, Lee MT, Weaver JF, Ralph P. Differentiation of the IL-3-dependent NFS-60 cell line and adaption to growth in macrophage colony-stimulating factor. J Immunol. 1990;145(3):860–4. PMID: 2142710Wadhwa M, Bird C, Hamill M, et al. The 2nd International Standard for human granulocyte colony stimulating factor. J Immunol Methods. 2011;367(1–2):63–9. https://doi.org/10.1016/j.jim.2011.02.005Wadhwa M, Bird C, Hamill M, et al. The 2nd International Standard for human granulocyte colony stimulating factor. J Immunol Methods. 2011;367(1–2):63–9. https://doi.org/10.1016/j.jim.2011.02.005Никонова ЮА, Аббасова СГ, Каргополова ПЕ и др. Валидация методики оценки биологической активности лекарственного препарата на основе тоцилизумаба и определение критериев приемлемости результатов анализа. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2024;14(3):317–29. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-317-329Nikonova YuA, Abbasova SG, Kargopolova PE, et al. Validation of an analytical procedure for evaluating the biological activity of a medicinal product based on tocilizumab and determination of acceptance criteria for test results. Regulatory Research and Medicine Evaluation. 2024;14(3):317–29 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-317-329Kirkland PD, Newberry KM. Your assay has changed — is it still “fit for purpose”? What evaluation is required. Rev Sci Tech. 2021;40(1):205–15. https://doi.org/10.20506/rst.40.1.3218Kirkland PD, Newberry KM. Your assay has changed — is it still “fit for purpose”? What evaluation is required. Rev Sci Tech. 2021;40(1):205–15. https://doi.org/10.20506/rst.40.1.3218

The authors declare that there are no conflicts of interest present.