Цыганова Галина Михайловна
ул. Погодинская, д. 10, стр. 1, Москва, 119121
Galina M. Tsyganova
10/1 Pogodinskaya St., Moscow 119121
Богословская Екатерина Денисовна
Институтский пер., д. 9, г. Долгопрудный, Московская область, 141701
Ekaterina D. Bogoslovskaya
9 Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141701
Шипулин Герман Александрович, канд. мед. наук
ул. Погодинская, д. 10, стр. 1, Москва, 119121
German A. Shipulin, Cand. Sci. (Med.)
10/1 Pogodinskaya St., Moscow 119121
Шипулина Ольга Юрьевна, канд. мед. наук
Бережковская наб., д. 20, стр. 13, Москва, 121059
Olga Yu. Shipulina, Cand. Sci. (Med.)
20/13 Berezhkovskaya Embk., Moscow 121059
Богословская Елена Владимировна, д-р мед. наук
ул. Погодинская, д. 10, стр. 1, Москва, 119121
Elena V. Bogoslovskaya, Dr. Sci. (Med.)
10/1 Pogodinskaya St., Moscow 119121
ВВЕДЕНИЕ. Высокая вариабельность генома РНК-содержащего вируса кори создает риск накопления мутаций в местах посадки (комплементарного связывания) праймеров, что может повлиять на надежность результатов молекулярной диагностики кори. В настоящей работе проведена оценка влияния таких мутаций на эффективность двух молекулярно-генетических методов — ПЦР и метода петлевой изотермической амплификации (LAMP).
ЦЕЛЬ. Оценить частоту встречаемости мутаций в местах связывания праймеров и их влияние на эффективность методов ПЦР и LAMP в выявлении РНК вируса кори.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовали нуклеотидные последовательности вируса кори из базы данных NCBI и клинические образцы носоглоточного секрета, предоставленные АО «ЛабКвест» (Москва, Россия). Экстракцию РНК вируса кори проводили с использованием набора реагентов «АмплиТест РИБО-преп». Амплификацию выполняли с использованием наборов реагентов «АмплиТест Корь» и методики LAMP. Биоинформатический анализ проводили с использованием программ MAFFT, Jalview 2.1, CD-HIT, MEGA12 и FigTree v.1.4.3.
РЕЗУЛЬТАТЫ. При анализе 1080 нуклеотидных последовательностей вируса кори было обнаружено не более одной замены в областях праймеров и зонда, используемых в ПЦР. Анализ последовательностей в местах посадки праймеров, используемых в LAMP, показал бóльшую вариабельность по сравнению с методом ПЦР, но и в этом случае 96,5% последовательностей содержало не более одной мутации в месте посадки каждого праймера. В 15 из 69 клинических образцов была выявлена только одна мутация в области посадки прямого праймера, которая незначительно влияла на эффективность ПЦР при низких концентрациях вируса. Для метода LAMP в 18 образцах было обнаружено три мутации в целевых последовательностях для праймеров F3, B1c и В2. В модельных экспериментах показано, что мисмэтч (несовпадение) во внешнем праймере F3 не влияет на скорость и чувствительность реакции, в то время как для петлевого праймера BIP была показана аномально высокая эффективность амплификации при наличии двух мутаций в РНК-последовательностях, что может косвенно свидетельствовать о наличии конформационных особенностей длинных петлевых праймеров.
ВЫВОДЫ. Оба метода — ПЦР и LAMP — эффективно выявляют РНК вируса кори даже при наличии мутаций в области посадки праймеров. Однако метод LAMP требует дальнейшего изучения для широкого внедрения в диагностику кори.
INTRODUCTION. The high variability of the measles virus RNA genome poses risks of mutations accumulating at primer binding sites (complementary binding site), potentially impacting the reliability of molecular measles diagnostics. In this study, we have assessed the impact of such mutations on the efficiency of two molecular genetic methods: PCR and loop-mediated isothermal amplification (LAMP).
AIM. This study aimed to evaluate the occurrence of mutations at primer binding sites and their impact on the efficiency of PCR and LAMP methods in detecting measles virus RNA.
MATERIALS AND METHODS. Clinical samples of nasopharyngeal secretions (LabQuest, Moscow, Russia) and nucleotide sequences from NCBI database were used in the study. AmpliTest RIBO-prep kit was used for RNA extraction. AmpliTest Measles kit and LAMP-based kit were used for amplification. MAFFT, Jalview 2.1, CD-HIT, MEGA1, and FigTree v.1.4.3 software were used to perform a bioinformatics analysis.
RESULTS. Having analyzed 1,080 nucleotide sequences of the measles virus, we found no more than one mutation in the target primers target sites and probe used for PCR. The analyzed LAMP primer binding sites showed greater variability compared to PCR primers; even in this case, 96.5% of the sequences contained no more than a single mutation at each site. Out of 69 clinical samples, only 15 had one mutation in the forward primer binding site, with a minor impact on PCR performance at low virus concentrations. For the LAMP method, three mutations were detected in the F3, B1c, and B2 primer target sites in 18 samples. In a model experiment, the mismatch in the region of the outer primer F3 did not affect the speed and sensitivity of the reaction. Inversely, the loop forming primer BIP performed abnormally well in the presence of two mutations in the RNA sequences. This can indirectly prove the existence of conformational aspects for long loop primers.
CONCLUSIONS. Both methods (PCR and LAMP) effectively detect samples with mutations; however, the LAMP method warrants further research to expand its potential for diagnosing measles.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.