biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2025-639biopreparat-639Research ArticleТЕМА НОМЕРА: РЕКОМБИНАНТНЫЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ БЕЛКИISSUE TOPIC RECOMBINANT THERAPEUTIC PROTEINSВалидация методики на основе биослойной интерферометрии для определения связывающих (общих) антител к ромиплостиму в сыворотке крови человекаValidation of a biolayer interferometry-based method for the determination of binding (total) antibodies to romiplostim in human serumhttps://orcid.org/0009-0005-9163-7991АгафоноваА. А.AgafonovaA. A.

Агафонова Алена Алексеевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Alena A. Agafonova

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinsky District, Vladimir region 601125

aaagafonova@generium.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9880-1724ЖиляеваМ. В.ZhilyaevaM. V.

Жиляева Мария Владимировна

ул. Маршала Рыбалко, д. 2, корпус 6, вн. тер. г. муниципальный округ Щукино, Москва, 123060

Maria V. Zhilyaeva

2/6 Marshal Rybalko St., Municipal District Shchukino, Moscow 123060

https://orcid.org/0000-0002-9058-1106ЛягоскинИ. В.LyagoskinI. V.

Лягоскин Иван Владимирович, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Ivan V. Lyagoskin, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinsky District, Vladimir region 601125

https://orcid.org/0000-0003-0682-6113КазаровА. А.KazarovA. A.

Казаров Александр Александрович

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Alexander A. Kazarov

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinsky District, Vladimir region 601125

https://orcid.org/0009-0000-1232-5660ЛисоваА. Е.LisovaA. E.

Лисова Алена Евгеньевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Alena E. Lisova

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinsky District, Vladimir region 601125

https://orcid.org/0000-0002-6532-7835ШукуровР. Р.ShukurovR. R.

Шукуров Рахим Рахманкулыевич, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Rakhim R. Shukurov, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinsky District, Vladimir region 601125

Акционерное общество «ГЕНЕРИУМ»РоссияGENERIUM JSCRussian FederationОбщество с ограниченной ответственностью «ГЕНОТЕРА»РоссияGENOTERA LLCRussian Federation202529092025253271283Copyright © Агафонова А.А., Жиляева М.В., Лягоскин И.В., Казаров А.А., Лисова А.Е., Шукуров Р.Р., 20252025Агафонова А.А., Жиляева М.В., Лягоскин И.В., Казаров А.А., Лисова А.Е., Шукуров Р.Р.Agafonova A.A., Zhilyaeva M.V., Lyagoskin I.V., Kazarov A.A., Lisova A.E., Shukurov R.R.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/639ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. В ряде случаев лечение ромиплостимом пациентов с идиопатической тромбоцитопенической пурпурой сопряжено с образованием антилекарственных антител (АЛА), что часто приводит к развитию серьезных неблагоприятных явлений. Для определения связывающих (общих) АЛА (оАЛА) к ромиплостиму в сыворотке крови человека предлагается методика, основанная на биослойной интерферометрии. С технической точки зрения использующие данный принцип приборы имеют некоторые преимущества (высокая пропускная способность, увеличенные межсервисные интервалы, низкий уровень контаминации оборудования при анализе биообразцов) перед приборами на основе поверхностного плазмонного резонанса, которые применяются для мониторинга оАЛА при проведении клинических исследований оригинального препарата. Для обеспечения воспроизводимости измерений и стандартизации лабораторного этапа клинических исследований иммуногенности биоаналогичного препарата необходима валидация методики.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ.   Установить    ключевые    валидационные    характеристики    методики,    основанной на биослойной   интерферометрии,   для   определения   общих   антилекарственных   антител к ромиплостиму в сыворотке крови человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Принцип метода заключается в детектировании специфического   взаимодействия   связывающих   антител,   содержащихся   в   исследуемых   образцах, с иммобилизованным на поверхности стрептавидиновых биосенсоров биотинилированным ромиплостимом. Методика состоит из этапа скрининг-теста, в котором определяется наличие или отсутствие оАЛА в образцах; подтверждающего теста для проверки специфичности связывания оАЛА с ромиплостимом; этапа определения титра антител, то есть предельного разведения, при котором оАЛА могут быть обнаружены в образцах. В работе использовались положительные контрольные образцы, содержащие различные концентрации поликлональных кроличьих антител к ромиплостиму. Детектирование белкового комплексообразования проводилось в режиме реального времени с использованием интерферометра Octet® QKe.

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Значения фактора   биологической   вариабельности   и   предельного   значения незначимого ингибирования составили 1,481 и   34,2%   соответственно.   Подтверждены прецизионность и специфичность методики. Нижний предел детекции оАЛА в отсутствие ромиплостима составил 622 нг/мл. При оценке эффекта матрицы в скрининг-тесте аналитический сигнал 8 из 10 образцов сыворотки крови после добавления оАЛА увеличился более чем в 1,481 раза; в подтверждающем тесте значение показателя «процент ингибирования» превышало 34,2% при анализе 8 из 10 образцов с добавлением оАЛА. Эффект высокой дозы оАЛА в концентрации от 0,8 до 50 мкг/мл отсутствовал. Результаты определения оАЛА в скрининг-тесте были устойчивы к присутствию 1 нг/мл ромиплостима в образцах. Стрептавидиновые биосенсоры с иммобилизованным ромиплостимом  сохраняли  стабильность  после  14  сут  хранения  при  температуре  5±3  °С и не менее 20 циклов регенерации.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Анализ полученных результатов валидации подтвердил пригодность методики на основе биослойной интерферометрии для достоверного и воспроизводимого определения связывающих (общих) антител к ромиплостиму в сыворотке крови человека.

INTRODUCTION

INTRODUCTION. Romiplostim treatment of patients with idiopathic thrombocytopenic purpura is associated with formation of anti-drug antibodies (ADA), which often leads to the serious adverse events. A method based on biolayer interferometry is proposed for determination of binding (total) ADA (bADA) to romiplostim in human serum. From a technological point of view, instruments using this principle have some advantages (higher throughput, prolonged service intervals, low level of equipment contamination during analysis of biosamples) over those based on surface plasmon resonance, which are used to monitor bADA levels during clinical trials of the original drug. The method should be validated to ensure reproducibility of measurements and standardise clinical laboratory trials of the immunogenicity of a biosimilar drug.

AIM

AIM. To establish the key validation characteristics of a biolayer interferometry-based method for the determination of total anti-drug antibodies to romiplostim in human serum.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. The method is used to detect the specific interaction of binding antibodies with biotinylated romiplostim immobilised on the streptavidin-coated biosensors. The method includes a screening test to determine bADA presence or absence in the samples; a confirmatory test to check the specificity of bADA binding to romiplostim; determination of antibody titer and maximal dilution, that allows to detect bADA in the samples. Positive control samples containing different concentrations of polyclonal rabbit antibodies to romiplostim were used in the work. Detection of protein complex formation was performed in real time mode using an Octet® QKe interferometer.

RESULTS

RESULTS.  The  biological  variability  factor  and  the  limit  of  not  significant  inhibition  were 1.481 and 34.2%, respectively. The precision and specificity of the method were confirmed. The lower limit of bADA detection in the absence of romiplostim was 622 ng/mL. The analytical signal of 8 out of 10 blood serum samples after the addition of bADA increased by more than 1.481 times when assessing the matrix effect in the screening test; the percentage inhibition value exceeded 34.2% when analysing 8 out of 10 samples with the addition of bADA in the confirmatory test. There was no high-dose effect at bADA concentrations from 0.8 to 50 μg/mL. The results of bADA determination in the screening test were robust to the presence of 1 ng/mL romiplostim in the samples. Streptavidin-coated biosensors with immobilised romiplostim maintained stability after 14 days of storage at a temperature of (5±3) °С and at least 20 regeneration cycles.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. Analysis of the validation results obtained confirms the suitability  of  the method for reliable and reproducible determination of binding (total) antibodies to romiplostim in human serum.

биослойная интерферометриясвязывающие антитела к ромиплостимувалидация аналитической методикиклиническая разработкабиоаналогичный лекарственный препаратbiolayer interferometryromiplostim binding antibodiesassay validationclinical developmentbiosimilar drugРабота выполнена за счет финансовой поддержки АО «ГЕНЕРИУМ».This study was funded by GENERIUM JSCReferencesМеликян АЛ, Егорова ЕК, Пустовая ЕИ, Колошейнова ТИ, Володичева ЕМ, Капорская ТС и др. Промежуточные результаты эпидемиологического исследования идиопатической тромбоцитопенической пурпуры у взрослых в Российской Федерации. Гематология и трансфузиология. 2019;64(4):436–46. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-436-446Melikyan AL, Egorova EK, Pustovaya EI, Kolosheynova TI, Volodicheva EM, Kaporskaya TS, et al. Interim results of epidemiological study of idiopathic thrombocytopenic purpura in adults in the Russian Federation: intermediate results. Hematology and Transfusiology. 2019;64(4):436–46 (In Russ.). https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-436-446Neunert C, Terrell DR, Arnold DM, Buchanan G, Cines DB, Cooper N, et al. American Society of Hematology 2019 guidelines for immune thrombocytopenia. Blood Adv. 2019;3(23):3829–66. https://doi.org/10.1182/bloodadvances.2019000966Neunert C, Terrell DR, Arnold DM, Buchanan G, Cines DB, Cooper N, et al. American Society of Hematology 2019 guidelines for immune thrombocytopenia. Blood Adv. 2019;3(23):3829–66. https://doi.org/10.1182/bloodadvances.2019000966Barger TE, Boshier A, Jawa V, Kim J, Mytych DT, Park J, et al. Assessment of romiplostim immunogenicity in adult patients in clinical trials and in a global registry. Blood. 2018;132 (Supplement 1):2427. https://doi.org/10.1182/blood-2018-99-113484Barger TE, Boshier A, Jawa V, Kim J, Mytych DT, Park J, et al. Assessment of romiplostim immunogenicity in adult patients in clinical trials and in a global registry. Blood. 2018;132 (Supplement 1):2427. https://doi.org/10.1182/blood-2018-99-113484Swanson SJ. What are clinically significant anti-drug antibodies and why is it important to identify them. Front Immunol. 2024;15:1401178. https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1401178Swanson SJ. What are clinically significant anti-drug antibodies and why is it important to identify them. Front Immunol. 2024;15:1401178. https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1401178Shankar G, Devanarayan V, Amaravadi L, Barrett YC, Bowsher R, Finco-Kent D, et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. J Pharm Biomed Anal. 2008;48(5):1267–81. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2008.09.020Shankar G, Devanarayan V, Amaravadi L, Barrett YC, Bowsher R, Finco-Kent D, et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. J Pharm Biomed Anal. 2008;48(5):1267–81. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2008.09.020Hagman C, Chasseigne G, Nelson R, Anlauff F, Kagan M, Goldfine AB, et al. Immunogenicity assessment strategy for a chemically modified therapeutic protein in clinical development. Front Immunol. 2024;15:1438251. https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1438251Hagman C, Chasseigne G, Nelson R, Anlauff F, Kagan M, Goldfine AB, et al. Immunogenicity assessment strategy for a chemically modified therapeutic protein in clinical development. Front Immunol. 2024;15:1438251. https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1438251Shibata H, Nishimura K, Miyama C, Tada M, Suzuki T, Saito Y, et al. Comparison of different immunoassay methods to detect human anti-drug antibody using the WHO erythropoietin antibody reference panel for analytes. J Immunol Methods. 2018;452:73–7. https://doi.org/10.1016/j.jim.2017.09.009Shibata H, Nishimura K, Miyama C, Tada M, Suzuki T, Saito Y, et al. Comparison of different immunoassay methods to detect human anti-drug antibody using the WHO erythropoietin antibody reference panel for analytes. J Immunol Methods. 2018;452:73–7. https://doi.org/10.1016/j.jim.2017.09.009Li J, Schantz A, Schwegler M, Shankar G. Detection of low-affinity anti-drug antibodies and improved drug tolerance in immunogenicity testing by Octet® biolayer interferometry. J Pharm Biomed Anal. 2011;54(2):286–94. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.08.022Li J, Schantz A, Schwegler M, Shankar G. Detection of low-affinity anti-drug antibodies and improved drug tolerance in immunogenicity testing by Octet® biolayer interferometry. J Pharm Biomed Anal. 2011;54(2):286–94. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.08.022Jug A, Bratkovič T, Ilaš J. Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. Trends Anal Chem. 2024;176:117741. https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.117741Jug A, Bratkovič T, Ilaš J. Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. Trends Anal Chem. 2024;176:117741. https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.117741Wadhwa M, Knezevic I, Kang H-N, Thorpe R. Immunogenicity assessment of biotherapeutic products: An overview of assays and their utility. Biologicals. 2015;43(5):298–306. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2015.06.004Wadhwa M, Knezevic I, Kang H-N, Thorpe R. Immunogenicity assessment of biotherapeutic products: An overview of assays and their utility. Biologicals. 2015;43(5):298–306. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2015.06.004Jani D, Marsden R, Mikulskis A, Gleason C, Klem T, Fiorotti CK, et al. Recommendations for the development and validation of confirmatory anti-drug antibody assays. Bioanalysis. 2015;7(13):1619–31. https://doi.org/10.4155/bio.15.96Jani D, Marsden R, Mikulskis A, Gleason C, Klem T, Fiorotti CK, et al. Recommendations for the development and validation of confirmatory anti-drug antibody assays. Bioanalysis. 2015;7(13):1619–31. https://doi.org/10.4155/bio.15.96Smith HW, Moxness M, Marsden R. Summary of confirmation cut point discussions. AAPS J. 2011;13(2):227–9. https://doi.org/10.1208/s12248-011-9263-zSmith HW, Moxness M, Marsden R. Summary of confirmation cut point discussions. AAPS J. 2011;13(2):227–9. https://doi.org/10.1208/s12248-011-9263-zGunn GR, Sealey DC, Jamali F, Meibohm B, Ghosh S, Shankar G. From the bench to clinical practice: understanding the challenges and uncertainties in immuno-genicity testing for biopharmaceuticals. Clin Exp Immunol. 2016;184(2):137–46. https://doi.org/10.1111/cei.12742Gunn GR, Sealey DC, Jamali F, Meibohm B, Ghosh S, Shankar G. From the bench to clinical practice: understanding the challenges and uncertainties in immuno-genicity testing for biopharmaceuticals. Clin Exp Immunol. 2016;184(2):137–46. https://doi.org/10.1111/cei.12742Tada M, Suzuki T, Ishii-Watabe A. Development and characterization of an anti-rituximab monoclonal antibody panel. MAbs. 2018;10(3):370–9. https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1424610Tada M, Suzuki T, Ishii-Watabe A. Development and characterization of an anti-rituximab monoclonal antibody panel. MAbs. 2018;10(3):370–9. https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1424610Namburi RP, Kancherla V, Ponnala AR. High-dose hook effect. J Dr NTR Univ Health Sci. 2014;3(1):5–7. https://doi.org/10.4103/2277-8632.128412Namburi RP, Kancherla V, Ponnala AR. High-dose hook effect. J Dr NTR Univ Health Sci. 2014;3(1):5–7. https://doi.org/10.4103/2277-8632.128412Varghese LN, Defour J-P, Pecquet C, Constantinescu SN. The Thrombopoietin receptor: structural basis of traffic and activation by ligand, mutations, agonists, and mutated calreticulin. Front Endocrinol (Lausanne). 2017;8:59. https://doi.org/10.3389/fendo.2017.00059Varghese LN, Defour J-P, Pecquet C, Constantinescu SN. The Thrombopoietin receptor: structural basis of traffic and activation by ligand, mutations, agonists, and mutated calreticulin. Front Endocrinol (Lausanne). 2017;8:59. https://doi.org/10.3389/fendo.2017.00059Qi J, Zheng L, Hu B, Zhou H, He Q, Liu H, et al. Pharmacokinetics, safety, and pharmacodynamics of romiplostim in chinese subjects with immune thrombocytopenia: a phase I/II trial. Clin Pharmacol Drug Dev. 2022;11(3):379–87. https://doi.org/10.1002/cpdd.1059Qi J, Zheng L, Hu B, Zhou H, He Q, Liu H, et al. Pharmacokinetics, safety, and pharmacodynamics of romiplostim in chinese subjects with immune thrombocytopenia: a phase I/II trial. Clin Pharmacol Drug Dev. 2022;11(3):379–87. https://doi.org/10.1002/cpdd.1059

The authors declare that there are no conflicts of interest present.