biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2025-631biopreparat-631Research ArticleТЕМА НОМЕРА: РЕКОМБИНАНТНЫЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ БЕЛКИISSUE TOPIC RECOMBINANT THERAPEUTIC PROTEINSОпределение антилекарственных антител к афлиберцепту методом иммуноферментного анализа: разработка и валидация методикиDetection of anti-drug antibodies to aflibercept by enzyme-linked immunosorbent assay: Development and validation of the methodhttps://orcid.org/0000-0001-6482-7814ШевченкоИ. В.ShevchenkoI. V.

Шевченко Иван Вячеславович, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Ivan V. Shevchenko, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

7h3d3m1ur63@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0000-1232-5660ЛисоваА. Е.LisovaA. E.

Лисова Алена Евгеньевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Alena E. Lisova

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

aelisova@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0009-0005-9163-7991АгафоноваА. А.AgafonovaA. A.

Агафонова Алена Алексеевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Alena А. Agafonova

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

aaagafonova@generium.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9135-9673СмоловаК. А.SmolovaK. A.

Смолова Ксения Александровна, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Ksenia A. Smolova, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

smolova@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0009-0002-4244-1106АлаеваИ. М.AlaevaI. M.

Алаева Ирина Михайловна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Irina M. Alaeva

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

i.alaeva@generium.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3817-2129ЖуковИ. Ю.ZhukovI. Yu.

Жуков Иван Юрьевич, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Ivan Yu. Zhukov, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

iyzhukov@generium.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0682-6113КазаровА. А.KazarovA. A.

Казаров Александр Александрович

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Aleksandr A. Kazarov

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

kazarov@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9058-1106ЛягоскинИ. В.LyagoskinI. V.

Лягоскин Иван Владимирович, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Ivan V. Lyagoskin, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

lyagoskin@ibcgenerium.ruАкционерное общество «ГЕНЕРИУМ»РоссияGENERIUM JSCRussian Federation202529092025253284295Copyright © Шевченко И.В., Лисова А.Е., Агафонова А.А., Смолова К.А., Алаева И.М., Жуков И.Ю., Казаров А.А., Лягоскин И.В., 20252025Шевченко И.В., Лисова А.Е., Агафонова А.А., Смолова К.А., Алаева И.М., Жуков И.Ю., Казаров А.А., Лягоскин И.В.Shevchenko I.V., Lisova A.E., Agafonova A.A., Smolova K.A., Alaeva I.M., Zhukov I.Y., Kazarov A.A., Lyagoskin I.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/631ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. Афлиберцепт применяется для лечения неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации, приводящей к потере зрения. К числу существенных побочных эффектов афлиберцепта относится его иммуногенность, проявляющаяся в виде выработки антилекарственных антител (АЛА). В рамках оценки иммуногенности препарата актуальной представляется разработка методики определения АЛА к афлиберцепту.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Разработка и валидация аналитической методики для иммуноферментного обнаружения и поэтапной характеристики общих антилекарственных антител к афлиберцепту в сыворотке крови человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Разработку методики проводили с применением метода твердофазного    иммуноферментного    анализа    (ИФА).    Использовали    афлиберцепт    (GNR-098, АО «ГЕНЕРИУМ», Россия) и конъюгат GNR-098 с пероксидазой хрена. Поликлональные антитела к GNR-098 получали путем иммунизации крыс, последующего отбора сыворотки крови и выделения из нее антител при помощи метода аффинной хроматографии. Обнаружение АЛА осуществляли с использованием меченого GNR-098 при постановке мостикового ИФА. Модельные образцы готовили, используя пулированные сыворотки здоровых доноров с добавлением крысиных поликлональных антител. Валидацию методики проводили по следующим параметрам: пределы исключения методик; прецизионность; предел обнаружения; устойчивость к присутствию в образцах растворимой мишени терапевтического белка; специфичность; эффект матрицы; минимальное необходимое разведение; стабильность; устойчивость к замене ключевого компонента; эффект сверхдозы (хук-эффект).

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Аналитическая методика включала скрининг-тест для определения возможного наличия АЛА, подтверждающий тест — для установления специфичности обнаруженных АЛА, тест для определения титра АЛА и их принадлежности к классу IgE. Пределы исключения методик для скрининг-теста и для теста определения АЛА класса IgE составили 1,3 и 1,2 соответственно; для подтверждающего теста — 15,2%. Предел обнаружения скрининг-теста составил 185 нг/мл. Продемонстрирована устойчивость методики к присутствию в образцах до 2000 пг/мл растворимой мишени терапевтического белка (hrVEGF165). Отсутствие эффекта матрицы установлено в скрининг-тесте и подтверждающем тесте 13 испытуемых образцов, содержащих АЛА в концентрации 280 нг/мл. Эффект сверхдозы не был установлен в скрининг-тесте и подтверждающем тесте образцов, содержащих АЛА в концентрации, пятикратно превышающей высокоположительный образец.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Разработана комплексная аналитическая методика для иммуноферментного обнаружения и поэтапной характеристики общих антилекарственных антител к афлиберцепту (препарат GNR-098) в сыворотке крови человека. Пригодность методики к применению подтверждена в ходе валидации. Разработанная аналитическая система позволит провести оценку иммуногенности афлиберцепта.

INTRODUCTION

INTRODUCTION. Aflibercept is used to treat neovascular age-related macular degeneration, a leading cause of vision loss. Immunogenicity is one of the significant adverse effects that results in the production of anti-drug antibodies (ADAs). The development of a method for detecting ADAs to aflibercept is essential for immunogenicity assessment.

AIM

AIM. This study aimed to develop and validate an analytical method for detection and stepwise characterisation of total anti-drug antibodies to aflibercept in human serum utilising the enzyme-linked immunosorbent assay.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. The method was developed using a solid-phase ELISA. Aflibercept (GNR-098, JSC GENERIUM, Russia) and a conjugate of GNR-098 with horseradish peroxidase were employed. Polyclonal antibodies against GNR-098 were obtained by immunising rats, followed by serum collection and antibody purification via affinity chromatography. ADA detection was performed using labelled GNR-098 in a bridging ELISA. Model samples were prepared by spiking pooled sera from healthy donors with rat polyclonal antibodies. Method validation included the following parameters: cut-off points; precision; limit of detection (LOD); drug tolerance; specificity; matrix effect; minimum required dilution; robustness; reagent stability; hook effect.

RESULTS

RESULTS. An analytical method includes a screening assay for the presumptive detection of ADAs; a confirmatory assay to establish ADA specificity and assay for ADA titer determination and IgE isotyping. The cut-off points for the screening assay and IgE-specific assay were 1.3 and 1.2, respectively; for the confirmatory assay, 15.2%. The LOD of the screening assay was 185 ng/mL. The method demonstrated drug tolerance (interference from soluble target, hrVEGF165) at concentrations up to 2,000 pg/mL. No matrix effects were observed in the screening or confirmatory assays across 13 test samples containing ADAs at 280 ng/mL. The absence of a hook effect was confirmed in both assays using samples with ADA concentrations five times higher than the high-positive control.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. An analytical method was developed for the ELISA-based detection and stepwise characterisation of total anti-drug antibodies to aflibercept (GNR-098) in human serum. The method’s suitability was confirmed through validation. This analytical procedure will facilitate the immunogenicity assessment of aflibercept.

афлиберцептбиоаналогантилекарственные антителаиммуноферментный анализИФАоценка иммуногенностиразработка методикивалидациявозрастная макулярная дегенерацияVEGFafliberceptbiosimilaranti-drug antibodiesELISAimmunogenicity evaluationmethod developmentvalidationage-related macular degenerationVEGFReferencesVeritti D, Sarao V, Gorni G, Lanzetta P. Anti-VEGF drugs dynamics: Relevance for clinical practice. Pharmaceutics. 2022;14(2):265. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14020265Veritti D, Sarao V, Gorni G, Lanzetta P. Anti-VEGF drugs dynamics: Relevance for clinical practice. Pharmaceutics. 2022;14(2):265. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14020265Anguita R, Tasiopoulou A, Shahid S, Roth J, Sim SY, Patel PJ. A review of aflibercept treatment for macular disease. Ophthalmol Ther. 2021;10(3):413–28. https://doi.org/10.1007/s40123-021-00354-1Anguita R, Tasiopoulou A, Shahid S, Roth J, Sim SY, Patel PJ. A review of aflibercept treatment for macular disease. Ophthalmol Ther. 2021;10(3):413–28. https://doi.org/10.1007/s40123-021-00354-1Sharma A, Kumar N, Parachuri N, Bandello F, Kuppermann BD. Immunogenicity: Clouding the future of intravitreal therapy. Ocul Immunol Inflamm. 2022;31(9):1746–9. https://doi.org10.1080/09273948.2022.2139273Sharma A, Kumar N, Parachuri N, Bandello F, Kuppermann BD. Immunogenicity: Clouding the future of intravitreal therapy. Ocul Immunol Inflamm. 2022;31(9):1746–9. https://doi.org10.1080/09273948.2022.2139273Gyenes A, Istvan L, Benyo F, Papp A, Resch M, Sandor N, et al. Intraocular neutralizing antibodies against aflibercept in patients with age related macular degeneration. BMC Ophthalmol. 2023;23(1):14. https://doi.org/10.1186/s12886-022-02761-9Gyenes A, Istvan L, Benyo F, Papp A, Resch M, Sandor N, et al. Intraocular neutralizing antibodies against aflibercept in patients with age related macular degeneration. BMC Ophthalmol. 2023;23(1):14. https://doi.org/10.1186/s12886-022-02761-9Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: A review. JAMA. 2024;331(2):147–47. https://doi.org/10.1001/jama.2023.26074Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: A review. JAMA. 2024;331(2):147–47. https://doi.org/10.1001/jama.2023.26074Harris C.T, Cohen, S. Reducing immunogenicity by design: Approaches to minimize immunogenicity of monoclonal antibodies. BioDrugs. 2024;38(3):205–26. https://doi.org/10.1007/s40259-023-00641-2Harris C.T, Cohen, S. Reducing immunogenicity by design: Approaches to minimize immunogenicity of monoclonal antibodies. BioDrugs. 2024;38(3):205–26. https://doi.org/10.1007/s40259-023-00641-2Koren E, Smith HW, Shores E, Shankar G, Finco-Kent D, Rup B, et al. Recommendations on risk-based strategies for detection and characterization of antibodies against biotechnology products. J Immunol Methods. 2008;333(1–2):1–9. https://doi.org/10.1016/j.jim.2008.01.001Koren E, Smith HW, Shores E, Shankar G, Finco-Kent D, Rup B, et al. Recommendations on risk-based strategies for detection and characterization of antibodies against biotechnology products. J Immunol Methods. 2008;333(1–2):1–9. https://doi.org/10.1016/j.jim.2008.01.001Иванов Р, Секарева Г, Кравцова О, Кудлай Д, Лукьянов С, Тихонова И и др. Правила проведения исследований биоаналоговых лекарственных средств (биоаналогов). Фармакокинетика и фармакодинамика. 2014;(1):21–36. EDN: SYTXJBIvanov R, Sekareva G, Kravtsova O, Kudlay D, Lukyanov S, Tikhonova I, et al. Guidelines of research biosimilar drugs. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2014;(1):21–36 (In Russ). EDN: SYTXJBPineda C, Castaneda Hernandez G, Jacobs IA, Alvarez DF, Carini C. Assessing the immunogenicity of biopharmaceuticals. BioDrugs. 2016;30(3):195–206. https://doi.org/10.1007/s40259-016-0174-5Pineda C, Castaneda Hernandez G, Jacobs IA, Alvarez DF, Carini C. Assessing the immunogenicity of biopharmaceuticals. BioDrugs. 2016;30(3):195–206. https://doi.org/10.1007/s40259-016-0174-5Shankar G, Devanarayan V, Amaravadi L, Barrett YC, Bowsher R, Finco-Kent D, et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. J Pharm Biomed Anal. 2008;48(5):1267–81. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2008.09.020Shankar G, Devanarayan V, Amaravadi L, Barrett YC, Bowsher R, Finco-Kent D, et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. J Pharm Biomed Anal. 2008;48(5):1267–81. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2008.09.020Carter PJ, Rajpal A. Designing antibodies as therapeutics. Cell. 2022;185(15):2789–805. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.05.029Carter PJ, Rajpal A. Designing antibodies as therapeutics. Cell. 2022;185(15):2789–805. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.05.029

The authors declare that there are no conflicts of interest present.