biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2024-24-3-312-321biopreparat-599Research ArticleТЕМА НОМЕРА: РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ, ЛЕЧЕБНЫХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВОВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯISSUE TOPIC: DEVELOPMENT OF MEDICINAL PRODUCTS FOR DIAGNOSIS, TREATMENT, AND PREVENTION OF VIRAL INFECTIONSИсследование защитной эффективности препарата КомбиМаб-2 против вируса иммунодефицита человека типа 1 на мышах, гуманизированных CD4+ Т-лимфоцитамиStudy of the protective efficacy of CombiMab-2 against human immunodeficiency virus type 1 in mice humanised with CD4+ T-lymphocyteshttps://orcid.org/0000-0001-7761-9870ЛеонтьевД. С.LeontyevD. S.

Леонтьев Данила Сергеевич, канд. биол. наук

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

Danila S. Leontyev, Cand. Sci. (Biol.)

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

danila.leontyev@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-2304-7787УрусовФ. А.UrusovF. A.

Урусов Феликс Анатольевич, канд. биол. наук

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

 

Felix A. Urusov, Cand. Sci. (Biol.)

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

Furusov@cspmz.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6083-4478ГлазковаД. В.GlazkovaD. V.

Глазкова Дина Викторовна, канд. биол. наук

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

Dina V. Glazkova, Cand. Sci. (Biol.)

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

Dglazkova@cspmz.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2646-9774БелугинБ. В.BeluginB. V.

Белугин Борис Владимирович, канд. биол. наук

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

Boris V. Belugin, Cand. Sci. (Biol.)

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

Bbelugin@cspfmba.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7882-8033ОрловаО. В.OrlovaO. V.

Орлова Ольга Владимировна, канд. биол. наук

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

Olga V. Orlova, Cand. Sci. (Biol.)

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

OOrlova@cspmz.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5398-3627МинтаевР. Р.MintaevR. R.

Минтаев Рамиль Рафаилович

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

Ramil R. Mintaev

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

RMintaev@cspfmba.ruhttps://orcid.org/0009-0002-1527-949XЦыгановаГ. М.TsyganovaG. M.

Цыганова Галина Михайловна

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

Galina M. Tsyganova

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

Tsyganova@cspmz.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3250-6498БогословскаяЕ. В.BogoslovskayaE. V.

Богословская Елена Владимировна, д-р мед. наук

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

Elena V. Bogoslovskaya, Dr. Sci. (Med.)

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

Bogoslovskaya@cspmz.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3668-6601ШипулинГ. А.ShipulinG. A.

Шипулин Герман Александрович, канд. мед. наук

Погодинская ул., д. 10, стр. 1, Москва, 119121

German A. Shipulin, Cand. Sci. (Med.)

10/1, Pogodinskaya St., Moscow 119121

Shipulin@cspfmba.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Федерального медико-биологического агентстваРоссияCentre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health RisksRussian FederationФедеральное государственное бюджетное учреждение «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Федерального медико-биологического агентства; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт медицины труда им. академика Н.Ф. Измерова»РоссияCentre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks; Izmerov Research Institute of Occupational HealthRussian Federation202403102024243Разработка диагностических, лечебных и профилактических препаратов противовирусного действия312321Copyright © Леонтьев Д.С., Урусов Ф.А., Глазкова Д.В., Белугин Б.В., Орлова О.В., Минтаев Р.Р., Цыганова Г.М., Богословская Е.В., Шипулин Г.А., 20242024Леонтьев Д.С., Урусов Ф.А., Глазкова Д.В., Белугин Б.В., Орлова О.В., Минтаев Р.Р., Цыганова Г.М., Богословская Е.В., Шипулин Г.А.Leontyev D.S., Urusov F.A., Glazkova D.V., Belugin B.V., Orlova O.V., Mintaev R.R., Tsyganova G.M., Bogoslovskaya E.V., Shipulin G.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/599ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. Несмотря на существующие подходы к терапии инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), полное излечение остается труднодостижимым из-за высокой изменчивости ВИЧ типа 1 (ВИЧ-1), что требует пожизненного приема антиретровирусных препаратов, обладающих серьезными побочными эффектами. Разработка генотерапевтических препаратов с использованием векторов на основе аденоассоциированных вирусов (adeno-associated virus, AAV), кодирующих нейтрализующие антитела широкого спектра действия (широко нейтрализующие антитела), является перспективным направлением для создания долгосрочной терапии в отношении большого количества вариантов вируса.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Оценка защитной эффективности препарата КомбиМаб-2, представляющего собой комбинацию трех AAV-векторов (AAV9-VRC07-523, AAV9-10-1074 и AAV9-PGDM1400), кодирующих широко нейтрализующие антитела против ВИЧ-1, на модели гуманизированных мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В исследовании использована животная модель ВИЧ-инфекции на основе иммунодефицитных мышей линии B-NDG, гуманизированных человеческими CD4+ Т-лимфоцитами в количестве 1,5×10⁷ клеток на мышь, полученными из лейкоконцентрата здорового донора. В эксперименте использовали две группы мышей. Контрольной группе животных (3 особи) вводили физиологический раствор, опытной группе (5 особей) — Комбимаб-2. Препарат в виде трех отдельных компонентов вводили в разные мышцы за 6 нед. до инфицирования животных вирусом. CCR5-тропный ВИЧ-1 получали путем трансфекции клеток HEK293FT плазмидой рNL4-3(AD8), кодирующей полноразмерный вирус. В течение 4 нед. после заражения проводили мониторинг вирусной нагрузки в плазме крови методом ПЦР с обратной транскрипцией и числа CD4+ Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии в периферической крови животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Установлено, что через 6 нед. после введения исследуемого препарата гуманизированным мышам уровень широко нейтрализующих антител в сыворотке крови животных варьировал от 0,17 до 4,0 мкг/мл. После заражения ВИЧ-1 в контрольной группе мышей уровень вирусной нагрузки составил 10⁵ копий/мл через 1 нед., далее наблюдалось увеличение показателя в течение последующих 3 нед. В группе животных, получавших препарат, инфекция развилась только у одной мыши, имевшей самый низкий титр антител. У остальных мышей вирусная нагрузка не детектировалась, что указывает на эффективность препарата при условии достижения концентрации широко нейтрализующих антител в сыворотке крови от 0,5 мкг/мл и выше.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Препарат на основе трех AAV-векторов (AAV9-VRC07-523, AAV9-10-1074 и AAV9-PGDM1400) обладает защитной эффективностью в отношении ВИЧ-1 в исследовании на гуманизированных мышах. Представленные данные позволяют рассматривать препарат как перспективное противовирусное средство, что может послужить основой для дальнейшей фармацевтической разработки.

INTRODUCTION

INTRODUCTION. Despite existing treatment methods, complete eradication of human immunodeficiency virus (HIV) infection remains an unattainable goal due to the high variability of HIV type 1 (HIV-1). HIV infection necessitates life-long administration of antiretroviral medicinal products, which cause serious adverse drug reactions. The development of gene therapy products based on adeno-associated virus (AAV) vectors encoding broadly neutralising antibodies represents a promising direction for creating long-term therapies capable of countering a wide range of viral variants.

AIM

AIM. This study aimed to evaluate the protective efficacy of CombiMab-2, a medicinal product consisting of a combination of three AAV vectors (AAV9-VRC07-523, AAV9-10-1074, and AAV9-PGDM1400) encoding broadly neutralising antibodies against HIV-1, in a humanised mouse model.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. The study used an HIV infection model based on immunodeficient B-NDG mice humanised with human CD4+ lymphocytes (1.5×107 cells per animal) from a leukoconcentrate of a healthy donor. The experiment used two groups of mice, including a control group (3 animals) receiving saline solution and an experimental group (5 animals) receiving CombiMab-2. The medicinal product was administered into different muscles as three separate components six weeks prior to infection. The CCR5-tropic HIV-1 strain was obtained by transfecting HEK293FT cells with the pNL4-3(AD8) plasmid encoding the full-length virus. The authors monitored viral loads in the plasma of animals by reverse transcription polymerase chain reaction and CD4+ lymphocyte counts in the peripheral blood of animals by flow cytometry for four weeks after infection.

RESULTS

RESULTS. Six weeks after CombiMab-2 administration, the levels of broadly neutralising antibodies in the serum of humanised mice ranged from 0.17 μg/mL to 4.0 μg/mL. In the control group, the viral load reached 105 copies/mL one week after HIV-1 infection and continued to rise over the next three weeks. In the treatment group, infection developed only in one mouse, which had the lowest antibody titre before infection. No viral load was detected in the remaining mice of the treatment group, which indicated that the medicinal product was effective if serum concentrations of broadly neutralising antibodies reached 0.5 μg/mL or higher.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. The tested medicinal product based on three AAV vectors (AAV9-VRC07-523, AAV9-10-1074, and AAV9-PGDM1400) exhibits protective activity against HIV-1 in humanised mice. The presented data allow the authors to consider CombiMab-2 as a promising antiviral agent that can serve as a basis for further pharmaceutical development.

гуманизированные мышивирус иммунодефицита человека типа 1ВИЧ-1CD4+ T-лимфоцитыаденоассоциированный вирусAAV-векторгенная терапияшироко нейтрализующие антителазащитная эффективностьпротивовирусная активностьhumanised micehuman immunodeficiency virus type 1HIV-1CD4+ T-lymphocytesadenoassociated virusAAV vectorgene therapybroadly neutralising antibodiesprotective efficacyantiviral activityРабота выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «ЦСП» ФМБА России «Пассивная иммунизация»The study reported in this publication was carried out by the Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks of the Federal Medical and Biological Agency of Russia as part of the publicly funded research project Passive Immunisation.ReferencesKamal S, Bugnon O, Cavassini M, Schneider MP. HIV-infected patients’ beliefs about their chronic co-treatments in comparison with their combined antiretroviral therapy. HIV Med. 2018;19(1):49–58. https://doi.org/10.1111/hiv.12542Kamal S, Bugnon O, Cavassini M, Schneider MP. HIV-infected patients’ beliefs about their chronic co-treatments in comparison with their combined antiretroviral therapy. HIV Med. 2018;19(1):49–58. https://doi.org/10.1111/hiv.12542Wu HF, Morris-Natschke SL, Xu XD, Yang MH, Cheng YY, Yu SS, Lee KH, et al. Recent advances in natural anti-HIV triterpenoids and analogs. Med Res Rev. 2020;40(6):2339–85. https://doi.org/10.1002/med.21708Wu HF, Morris-Natschke SL, Xu XD, Yang MH, Cheng YY, Yu SS, Lee KH, et al. Recent advances in natural anti-HIV triterpenoids and analogs. Med Res Rev. 2020;40(6):2339–85. https://doi.org/10.1002/med.21708Chirenje ZM, Marrazzo J, Parikh UM. Antiretroviral-based HIV prevention strategies for women. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010;8(10):1177–86. https://doi.org/10.1586/eri.10.79Chirenje ZM, Marrazzo J, Parikh UM. Antiretroviral-based HIV prevention strategies for women. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010;8(10):1177–86. https://doi.org/10.1586/eri.10.79Gruell H, Klein F. Antibody-mediated prevention and treatment of HIV-1 infection. Retrovirology. 2018;15(1):73. https://doi.org/10.1186/s12977-018-0455-9Gruell H, Klein F. Antibody-mediated prevention and treatment of HIV-1 infection. Retrovirology. 2018;15(1):73. https://doi.org/10.1186/s12977-018-0455-9Walker L, Huber M, Doores K, Falkowska E, Pejchal R, Julien J, et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 2011;477(7365):466–70. https://doi.org/10.1038/nature10373Walker L, Huber M, Doores K, Falkowska E, Pejchal R, Julien J, et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 2011;477(7365):466–70. https://doi.org/10.1038/nature10373Lynch RM, Boritz E, Coates EE, DeZure A, Madden P, Costner P, et al. Virologic effects of broadly neutralizing antibody VRC01 administration during chronic HIV-1 infection. Sci Transl Med. 2015;7(319):319ra206. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aad5752Lynch RM, Boritz E, Coates EE, DeZure A, Madden P, Costner P, et al. Virologic effects of broadly neutralizing antibody VRC01 administration during chronic HIV-1 infection. Sci Transl Med. 2015;7(319):319ra206. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aad5752Caskey M, Klein F, Lorenzi JC, Seaman MS, West AP Jr, Buckley N, et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 2015;522(7557):487–91. https://doi.org/10.1038/nature14411Caskey M, Klein F, Lorenzi JC, Seaman MS, West AP Jr, Buckley N, et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 2015;522(7557):487–91. https://doi.org/10.1038/nature14411Bar-On Y, Gruell H, Schoofs T, Pai JA, Nogueira L, Butler AL, et al. Safety and anti-viral activity of combination HIV-1 broadly neutralizing antibodies in viremic individuals. Nat Med. 2018;24(11):1701–7. https://doi.org/10.1038/s41591-018-0186-4Bar-On Y, Gruell H, Schoofs T, Pai JA, Nogueira L, Butler AL, et al. Safety and anti-viral activity of combination HIV-1 broadly neutralizing antibodies in viremic individuals. Nat Med. 2018;24(11):1701–7. https://doi.org/10.1038/s41591-018-0186-4LaMont C, Otwinowski J, Vanshylla K, Gruell H, Klein F, Nourmohammad A. Design of an optimal combination therapy with broadly neutralizing antibodies to suppress HIV-1. Elife. 2022;11:e76004. https://doi.org/10.7554/eLife.76004LaMont C, Otwinowski J, Vanshylla K, Gruell H, Klein F, Nourmohammad A. Design of an optimal combination therapy with broadly neutralizing antibodies to suppress HIV-1. Elife. 2022;11:e76004. https://doi.org/10.7554/eLife.76004Waters L, Miguel-Buckley R, Poulin S, Arribas J. Broadly neutralizing antibodies for HIV treatment: broad in theory, narrow in reality. Clin Infect Dis. 2023;76(6):1136–41. https://doi.org/10.1093/cid/ciac835Waters L, Miguel-Buckley R, Poulin S, Arribas J. Broadly neutralizing antibodies for HIV treatment: broad in theory, narrow in reality. Clin Infect Dis. 2023;76(6):1136–41. https://doi.org/10.1093/cid/ciac835Choudhry V, Zhang M, Dimitrova D, Prabakaran P, Dimitrov A, Fouts T, et al. Antibody-based inhibitors of HIV infection. Expert Opin Biol Ther. 2006;6(5):523–31. https://doi.org/10.1517/14712598.6.5.523Choudhry V, Zhang M, Dimitrova D, Prabakaran P, Dimitrov A, Fouts T, et al. Antibody-based inhibitors of HIV infection. Expert Opin Biol Ther. 2006;6(5):523–31. https://doi.org/10.1517/14712598.6.5.523Wang D, Tai P, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358–78. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9Wang D, Tai P, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358–78. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9Bennett MS, Akkina R. Gene therapy strategies for HIV/AIDS: preclinical modeling in humanized mice. Viruses. 2013;5(12):3119–41. https://doi.org/10.3390/v5123119Bennett MS, Akkina R. Gene therapy strategies for HIV/AIDS: preclinical modeling in humanized mice. Viruses. 2013;5(12):3119–41. https://doi.org/10.3390/v5123119Van den Berg FT, Makoah NA, Ali SA, Scott TA, Mapengo RE, Mutsvunguma LZ, et al. AAV-mediated expression of broadly neutralizing and vaccine-like antibodies targeting the HIV-1 envelope V2 region. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019;14:100–12. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.06.002Van den Berg FT, Makoah NA, Ali SA, Scott TA, Mapengo RE, Mutsvunguma LZ, et al. AAV-mediated expression of broadly neutralizing and vaccine-like antibodies targeting the HIV-1 envelope V2 region. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019;14:100–12. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.06.002Shipulin GA, Glazkova DV, Urusov FA, Belugin BV, Dontsova V, Panova AV, et al. Triple combinations of AAV9-vectors encoding Anti-HIV bNAbs provide longterm in vivo expression of human IgG effectively neutralizing pseudoviruses from HIV-1 global panel. Viruses. 2024;16(8):1296. https://doi.org/10.3390/v16081296Shipulin GA, Glazkova DV, Urusov FA, Belugin BV, Dontsova V, Panova AV, et al. Triple combinations of AAV9-vectors encoding Anti-HIV bNAbs provide longterm in vivo expression of human IgG effectively neutralizing pseudoviruses from HIV-1 global panel. Viruses. 2024;16(8):1296. https://doi.org/10.3390/v16081296Kim KC, Choi BS, Kim KC, Park KH, Lee HJ, Cho YK, et al. A simple mouse model for the study of human immunodeficiency virus. AIDS Res Hum Retroviruses. 2016;32(2):194–202. https://doi.org/10.1089/AID.2015.0211Kim KC, Choi BS, Kim KC, Park KH, Lee HJ, Cho YK, et al. A simple mouse model for the study of human immunodeficiency virus. AIDS Res Hum Retroviruses. 2016;32(2):194–202. https://doi.org/10.1089/AID.2015.0211Søndergaard H, Kvist PH, Haase C. Human T cells de pend on functional calcineurin, tumour necrosis factor-α and CD80/CD86 for expansion and activation in mice. Clin Exp Immunol. 2013;172(2):300–10. https://doi.org/10.1111/cei.12051Søndergaard H, Kvist PH, Haase C. Human T cells de pend on functional calcineurin, tumour necrosis factor-α and CD80/CD86 for expansion and activation in mice. Clin Exp Immunol. 2013;172(2):300–10. https://doi.org/10.1111/cei.12051Kochina E, Urusov F, Kruglov A, Glazkova D, Shipulin G, Bogoslovskaya E. Double and triple combinations of broadly neutralizing antibodies provide efficient neutralization of all HIV-1 strains from the global panel. Viruses. 2022;14(9):1910. https://doi.org/10.3390/v14091910Kochina E, Urusov F, Kruglov A, Glazkova D, Shipulin G, Bogoslovskaya E. Double and triple combinations of broadly neutralizing antibodies provide efficient neutralization of all HIV-1 strains from the global panel. Viruses. 2022;14(9):1910. https://doi.org/10.3390/v14091910van der Velden YU, Villaudy J, Siteur-van Rijnstra E, van der Linden CA, Frankin E, Weijer K, et al. Short communication: protective efficacy of broadly neutralizing antibody PGDM1400 against HIV-1 challenge in humanized mice. AIDS Res Hum Retroviruses. 2018;34(9):790–3. https://doi.org/10.1089/AID.2018.0114van der Velden YU, Villaudy J, Siteur-van Rijnstra E, van der Linden CA, Frankin E, Weijer K, et al. Short communication: protective efficacy of broadly neutralizing antibody PGDM1400 against HIV-1 challenge in humanized mice. AIDS Res Hum Retroviruses. 2018;34(9):790–3. https://doi.org/10.1089/AID.2018.0114Horwitz JA, Halper-Stromberg A, Mouquet H, Gitlin AD, Tretiakova A, Eisenreich TR, et al. HIV-1 suppression and durable control by combining single broadly neutralizing antibodies and antiretroviral drugs in humanized mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110(41):16538–43. https://doi.org/10.1073/pnas.1315295110Horwitz JA, Halper-Stromberg A, Mouquet H, Gitlin AD, Tretiakova A, Eisenreich TR, et al. HIV-1 suppression and durable control by combining single broadly neutralizing antibodies and antiretroviral drugs in humanized mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110(41):16538–43. https://doi.org/10.1073/pnas.1315295110Balazs AB, Chen J, Hong CM, Rao DS, Yang L, Baltimore D. Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis. Nature. 2011;481(7379):81–4. https://doi.org/10.1038/nature10660Balazs AB, Chen J, Hong CM, Rao DS, Yang L, Baltimore D. Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis. Nature. 2011;481(7379):81–4. https://doi.org/10.1038/nature10660Casazza JP, Cale EM, Narpala S, Yamshchikov GV, Coates EE, Hendel CS, et al. Safety and tolerability of AAV8 delivery of a broadly neutralizing antibody in adults living with HIV: a phase 1, dose-escalation trial. Nat Med. 2022;28(5):1022–30. https://doi.org/10.1038/s41591-022-01762-xCasazza JP, Cale EM, Narpala S, Yamshchikov GV, Coates EE, Hendel CS, et al. Safety and tolerability of AAV8 delivery of a broadly neutralizing antibody in adults living with HIV: a phase 1, dose-escalation trial. Nat Med. 2022;28(5):1022–30. https://doi.org/10.1038/s41591-022-01762-xLin A, Balazs AB. Adeno-associated virus gene delivery of broadly neutralizing antibodies as prevention and therapy against HIV-1. Retrovirology. 2018;15(1):66. https://doi.org/10.1186/s12977-018-0449-7Lin A, Balazs AB. Adeno-associated virus gene delivery of broadly neutralizing antibodies as prevention and therapy against HIV-1. Retrovirology. 2018;15(1):66. https://doi.org/10.1186/s12977-018-0449-7

The authors declare that there are no conflicts of interest present.