biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2024-24-2-215-228biopreparat-582Research ArticleТЕМА НОМЕРА: ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫISSUE TOPIC: ADVANCED THERAPY MEDICINAL PRODUCTSОценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo методом секвенирования нового поколенияIn vivo evaluation of tropism and biodistribution of synthetic and natural adeno-associated viral vectors by next-generation sequencinghttps://orcid.org/0000-0002-2937-6082МаксимовД. О.MaksimovD. O.

Максимов Денис Олегович

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Москва, 119991

Балтийская, д. 8, Москва, 125315

Denis O. Maksimov

Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

1/3 Leninskie Gory, Moscow 119991

8 Baltiyskaya St., Moscow 125315, Russian Federation

maksimov.do@mipt.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1242-2046НаумоваД. А.NaumovaD. A.

Наумова Дарья Алексеевна

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Daria A. Naumova

Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

naumova.da@mipt.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4737-5892АстаховаЕ. А.AstakhovaE. A.

Астахова Екатерина Андреевна

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Ekaterina A. Astakhova

Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

ast_kat@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0001-1774-6656АртемьевВ. В.ArtemevV. V.

Артемьев Валентин Владимирович

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Valentin V. Artemev

Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

artemev.vv@mipt.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5662-3651БирюковС. А.BiryukovS. A.

Бирюков Станислав Анатольевич, д-р физ.-мат. наук

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Stanislav A. Biryukov, Dr. Sci. (Phys. and Math.)

Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

biryukov.sa@mipt.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6954-1564АбрамовИ. С.AbramovI. S.

Абрамов Иван Сергеевич

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Москва, 119991

ул. Балтийская, д. 8, Москва, 125315

Ivan S. Abramov

Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

1 Novogireevskaya St., Moscow 111123

8 Baltiyskaya St., Moscow 125315

abramov.is@mipt.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0224-1396НавойковаА. А.NavoikovaA. A.

Навойкова Анна Александровна

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Anna A. Navoikova

9 Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

navoikova.aa@mipt.ruhttps://orcid.org/0009-0000-2379-0218РудевН. В.RudevN. V.

Рудев Николай Валерьевич

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

ул. Балтийская, д. 8, Москва, 125315

Nikolai V. Rudev

9 Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

8 Baltiyskaya St., Moscow 125315

rudev.nv@mipt.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7608-439XФеоктистоваС. Г.FeoktistovaS. G.

Феоктистова Софья Гумаровна

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

ул. Балтийская, д. 8, Москва, 125315

Sofia G. Feoktistova

9 Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

8 Baltiyskaya St., Moscow 125315

feoktistova.sg@mipt.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7199-1866ГлазоваО. В.GlazovaO. V.

Глазова Ольга Владимировна

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

ул. Балтийская, д. 8, Москва, 125315

Olga V. Glazova

9 Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

8 Baltiyskaya St., Moscow 125315

https://orcid.org/0000-0001-9252-1601МитяеваО. Н.MityaevaO. N.

Митяева Ольга Николаевна, канд. биол. наук

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Москва, 119991

ул. Балтийская, д. 8, Москва, 125315

Olga N. Mityaeva, Cand. Sci. (Biol.)

Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

1/3 Leninskie Gory, Moscow 119991

8 Baltiyskaya St., Moscow 125315, Russian Federation

mitiaeva.on@mipt.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9794-6297ВолчковП. Ю.VolchkovP. Yu.

Волчков Павел Юрьевич, канд. биол. наук

Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700

Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Москва, 119991

ул. Новогиреевская, д. 1, Москва, 111123

ул. Балтийская, д. 8, Москва, 125315

Pavel Yu. Volchkov, Cand. Sci. (Biol.)

Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700

1/3 Leninskie Gory, Moscow 119991

1 Novogireevskaya St., Moscow 111123

8 Baltiyskaya St., Moscow 125315, Russian Federation

volchkov.piu@mipt.ruФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий»РоссияMoscow Institute of Physics and Technology; Lomonosov Moscow State University; Federal Research Center for Innovator and Emerging Biomedical and Pharmaceutical TechnologiesRussian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»РоссияMoscow Institute of Physics and TechnologyRussian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»; Государственное бюджетное учреждение здравоохранения г. Москвы «Московский клинический научно-практический центр имени А.С. Логинова Департамента здравоохранения г. Москвы»; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий»РоссияMoscow Institute of Physics and Technology; A.S. Loginov Moscow Clinical Research Center; Federal Research Center for Innovator and Emerging Biomedical and Pharmaceutical TechnologiesRussian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий»РоссияMoscow Institute of Physics and Technology; Federal Research Center for Innovator and Emerging Biomedical and Pharmaceutical TechnologiesRussian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий»РоссияMoscow Institute of Physics and Technology; Lomonosov Moscow State University; Federal Research Center for Innovator and Emerging Biomedical and Pharmaceutical TechnologiesRussian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»; Государственное бюджетное учреждение здравоохранения г. Москвы «Московский клинический научно-практический центр имени А.С. Логинова Департамента здравоохранения г. Москвы»; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий»РоссияMoscow Institute of Physics and Technology; Lomonosov Moscow State University; A.S. Loginov Moscow Clinical Research Center; Federal Research Center for Innovator and Emerging Biomedical and Pharmaceutical TechnologiesRussian Federation202414062024242Высокотехнологичные лекарственные препараты215228Copyright © Максимов Д.О., Наумова Д.А., Астахова Е.А., Артемьев В.В., Бирюков С.А., Абрамов И.С., Навойкова А.А., Рудев Н.В., Феоктистова С.Г., Глазова О.В., Митяева О.Н., Волчков П.Ю., 20242024Максимов Д.О., Наумова Д.А., Астахова Е.А., Артемьев В.В., Бирюков С.А., Абрамов И.С., Навойкова А.А., Рудев Н.В., Феоктистова С.Г., Глазова О.В., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.Maksimov D.O., Naumova D.A., Astakhova E.A., Artemev V.V., Biryukov S.A., Abramov I.S., Navoikova A.A., Rudev N.V., Feoktistova S.G., Glazova O.V., Mityaeva O.N., Volchkov P.Y.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/582

ВВЕДЕНИЕ. Создание синтетических векторов на основе аденоассоциированных вирусов (ААВ) при разработке препаратов для генной терапии является трудоемким и дорогостоящим процессом. Для ускорения и снижения стоимости разработки генотерапевтических препаратов оптимальным представляется совершенствование методов оценки биораспределения и эффективности трансдукции in vivo ААВ векторов.ЦЕЛЬ. Разработка методики биоинформатической оценки библиотек синтетических векторов на основе ААВ для анализа биораспределения и эффективности трансдукции ААВ in vivo.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Конструировали синтетические ААВ векторы путем добавления специальной метки (баркода), специфичной для каждого исследуемого серотипа ААВ — 12-нуклеотидной последовательности, фланкированной с 5'-конца кодирующей последовательностью репортерного белка (зеленый флуоресцентный белок). Плазмиды с уникальными баркодами нарабатывали в компетентных клетках Escherichia coli XL10-Gold и использовали для сборки ААВ-библиотек: ААВ-библиотека L1 — с количеством вирусных геномов (вг) 10¹⁰; библиотека L2 с количеством вг — 10¹¹. Для продукции ААВ проводили трансфекцию клеток НЕК293Т. Векторы в виде двух ААВ-библиотек вводили внутривенно мышам линии С57В1/6N. Из органов и тканей животных выделяли ДНК и РНК для последующего анализа методом секвенирования нового поколения. Анализировали количество ДНК- и РНК-баркодов в органах мышей для оценки биораспределения и эффективности трансдукции ААВ. Баркоды идентифицировали с помощью выравнивания на ожидаемые последовательности, затем подсчитывали их количество и нормировали на количество в исходной библиотеке.РЕЗУЛЬТАТЫ. Созданы 7 вирусных конструкций на основе ААВ различных серотипов, 6 из которых — синтетические (sААВ1, sААВ2, sААВ3, sААВ4, sААВ5, sААВ6), в составе двух ААВ-библиотек. При проведении секвенирования образцов из органов мышей обнаружено значимое количество ДНК-баркодов обеих ААВ-библиотек в образцах всех органов, за исключением мозга. Для библиотеки L1 детектированы РНК-баркоды на достаточном уровне в четырех органах: скелетная мускулатура, сердце, печень и надпочечники; для библиотеки L2 — дополнительно к перечисленным органам в гонадах и почках. При анализе эффективности трансдукции (по уровню РНК-баркодов с поправкой на ДНК-баркоды) показано, что наиболее перспективными вариантами для генной терапии заболеваний печени является sAAВ5, а для заболеваний надпочечников — sAAВ2 и sAAВ6.ВЫВОДЫ. Разработанная методика биоинформатической оценки библиотек синтетических векторов на основе ААВ позволяет проводить анализ биораспределения и эффективности трансдукции ААВ векторов в организме. Предложенный подход является перспективным для подбора оптимальных ААВ векторов для конкретных органов и тканей при разработке генотерапевтических препаратов.

INTRODUCTION. The creation of synthetic adeno-associated virus (AAV) vectors during gene therapy development is a labour-intensive and expensive process. The optimal solution to minimise the time and costs associated with gene therapy development lies in the improvement of methods aimed at assessing AAV vector biodistribution and transduction efficiency in vivo.AIM. This study aimed to develop a new bioinformatics-based assessment method for synthetic AAV vector libraries to analyse AAV vector biodistribution and transduction efficiency in vivo.MATERIALS AND METHODS. The production of synthetic AAV vectors involved assigning AAV serotype-specific barcodes (12-nucleotide tags flanked at the 5' end with a sequence encoding the green fluorescent reporter protein). Plasmids carrying unique barcodes were propagated in competent Escherichia coli XL10-Gold cells and used to create two AAV libraries: L1 with a viral genome count of 1010 and L2 with a viral genome count of 1011. AAV production involved HEK293T cell transfection. L1 and L2 library vectors were administered to C57Bl/6N mice by intravenous injection. DNA and RNA were isolated from transduced organs for analysis by next-generation sequencing. The obtained data on DNA and RNA barcode quantities in different murine organs were analysed to assess the biodistribution and transduction efficiency of synthetic AAVs. Barcodes were identified by aligning them to the expected sequences and counted. The resulting values were normalised to the quantity of barcodes in the original library.RESULTS. Seven viral constructs based on different AAV serotypes were created as part of two AAV libraries. Six of the AAV serotypes were synthetic (sAAV1, sAAV2, sAAV3, sAAV4, sAAV5, and sAAV6). Sequencing of murine organ samples revealed significant quantities of DNA barcodes from both AAV libraries in all organs except the brain. For the L1 library, RNA barcodes were detected at a sufficient level in 4 organs, including the skeletal muscles, the heart, the liver, and the adrenal glands. For the L2 library, in addition to the listed organs, sufficient RNA-barcode levels were observed in the gonads and the kidneys. According to transduction efficiency analysis based on RNA barcode levels adjusted for DNA barcodes, sAAV5 was considered the most promising variant for gene therapy of liver-related diseases, whereas sAAV2 and sAAV6 were recognised as holding the most promise for adrenal diseases.CONCLUSIONS. The developed bioinformatics-based assessment method for synthetic AAV vector libraries can analyse AAV vector biodistribution and transduction efficiency in the body. The presented approach has the potential for selecting optimal AAV vectors for specific organs and tissues in further gene therapy development.

аденоассоциированный вирусААВсинтетический векторбиблиотека синтетических векторовААВ-библиотекабаркодированиеДНК-баркодРНК-баркодсеротипы ААВсеквенирование нового поколениябиоинформатический анализбиораспределениеэффективность трансдукции in vivoтропизмгенная терапияadeno-associated virusAAVsynthetic vectorsynthetic vector libraryAAV librarybarcodingDNA barcodeRNA barcodeAAV serotypesnext-generation sequencingNGSbioinformatics analysisbiodistributiontransduction efficiency in vivotropismgene therapyРабота выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 23-64-00002).The study was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 23-64-00002).ReferencesWang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358–78. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358–78. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9Srivastava A. In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors. Curr Opin Virol. 2016;21:75–80. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2016.08.003Srivastava A. In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors. Curr Opin Virol. 2016;21:75–80. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2016.08.003Pañeda A, Vanrell L, Mauleon I, Crettaz JS, Berraondo P, Timmermans EJ, et al. Effect of adeno-associated virus serotype and genomic structure on liver transduction and biodistribution in mice of both genders. Hum Gene Ther. 2009;20(8):908–17. https://doi.org/10.1089/hum.2009.031Pañeda A, Vanrell L, Mauleon I, Crettaz JS, Berraondo P, Timmermans EJ, et al. Effect of adeno-associated virus serotype and genomic structure on liver transduction and biodistribution in mice of both genders. Hum Gene Ther. 2009;20(8):908–17. https://doi.org/10.1089/hum.2009.031Hauck B, Xiao W. Characterization of tissue tropism determinants of adeno-associated virus type 1. J Virol. 2003;77(4):2768–74. https://doi.org/10.1128/jvi.77.4.2768-2774.2003Hauck B, Xiao W. Characterization of tissue tropism determinants of adeno-associated virus type 1. J Virol. 2003;77(4):2768–74. https://doi.org/10.1128/jvi.77.4.2768-2774.2003Han J, Zhu L, Zhang J, Guo L, Sun X, Huang C, et al. Rational engineering of adeno-associated virus capsid enhances human hepatocyte tropism and reduces immunogenicity. Cell Prolif. 2022;55(12):e13339. https://doi.org/10.1111/cpr.13339Han J, Zhu L, Zhang J, Guo L, Sun X, Huang C, et al. Rational engineering of adeno-associated virus capsid enhances human hepatocyte tropism and reduces immunogenicity. Cell Prolif. 2022;55(12):e13339. https://doi.org/10.1111/cpr.13339Li C, Samulski RJ. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 2020;21(4):255–72. https://doi.org/10.1038/s41576-019-0205-4Li C, Samulski RJ. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 2020;21(4):255–72. https://doi.org/10.1038/s41576-019-0205-4Rode L, Bär C, Groß S, Rossi A, Meumann N, Viereck J, et al. AAV capsid engineering identified two novel variants with improved in vivo tropism for cardiomyocytes. Mol Ther. 2022;30(12):3601–18. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.07.003Rode L, Bär C, Groß S, Rossi A, Meumann N, Viereck J, et al. AAV capsid engineering identified two novel variants with improved in vivo tropism for cardiomyocytes. Mol Ther. 2022;30(12):3601–18. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.07.003Ghauri MS, Ou L. AAV engineering for improving tropism to the central nervous system. Biology (Basel). 2023;12(2):186. https://doi.org/10.3390/biology12020186Ghauri MS, Ou L. AAV engineering for improving tropism to the central nervous system. Biology (Basel). 2023;12(2):186. https://doi.org/10.3390/biology12020186Drouyer M, Chu TH, Labit E, Haase F, Navarro RG, Nazareth D, et al. Novel AAV variants with improved tropism for human Schwann cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2024;32(2):101234. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2024.101234Drouyer M, Chu TH, Labit E, Haase F, Navarro RG, Nazareth D, et al. Novel AAV variants with improved tropism for human Schwann cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2024;32(2):101234. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2024.101234Gigout L, Rebollo P, Clement N, Warrington KH, Muzyczka N, Linden RM, et al. Altering AAV tropism with mosaic viral capsids. Mol Ther. 2005;11(6):856–65. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2005.03.005Gigout L, Rebollo P, Clement N, Warrington KH, Muzyczka N, Linden RM, et al. Altering AAV tropism with mosaic viral capsids. Mol Ther. 2005;11(6):856–65. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2005.03.005Wu Z, Asokan A, Grieger JC, Govindasamy L, AgbandjeMcKenna M, Samulski RJ. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 2006;80(22):11393–7. https://doi.org/10.1128/jvi.01288-06Wu Z, Asokan A, Grieger JC, Govindasamy L, AgbandjeMcKenna M, Samulski RJ. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 2006;80(22):11393–7. https://doi.org/10.1128/jvi.01288-06Asokan A, Conway JC, Phillips JL, Li C, Hegge J, Sinnott R, et al. Reengineering a receptor footprint of adeno-associated virus enables selective and systemic gene transfer to muscle. Nat Biotechnol. 2010;28(1):79–82. https://doi.org/10.1038/nbt.1599Asokan A, Conway JC, Phillips JL, Li C, Hegge J, Sinnott R, et al. Reengineering a receptor footprint of adeno-associated virus enables selective and systemic gene transfer to muscle. Nat Biotechnol. 2010;28(1):79–82. https://doi.org/10.1038/nbt.1599Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(18):11854–9. https://doi.org/10.1073/pnas.182412299Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(18):11854–9. https://doi.org/10.1073/pnas.182412299Gao G, Vandenberghe LH, Alvira MR, Lu Y, Calcedo R, Zhou X, et al. Clades of adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol. 2004;78(12):6381–8. https://doi.org/10.1128/jvi.78.12.6381-6388.2004Gao G, Vandenberghe LH, Alvira MR, Lu Y, Calcedo R, Zhou X, et al. Clades of adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol. 2004;78(12):6381–8. https://doi.org/10.1128/jvi.78.12.6381-6388.2004Zinn E, Pacouret S, Khaychuk V, Turunen HT, Carvalho LS, Andres-Mateos E, et al. In silico reconstruction of the viral evolutionary lineage yields a potent gene therapy vector. Cell Rep. 2015;12(6):1056–8. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.07.019Zinn E, Pacouret S, Khaychuk V, Turunen HT, Carvalho LS, Andres-Mateos E, et al. In silico reconstruction of the viral evolutionary lineage yields a potent gene therapy vector. Cell Rep. 2015;12(6):1056–8. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.07.019Szumska J, Grimm D. Boosters for adeno-associated virus (AAV) vector (r)evolution. Cytotherapy. 2023;25(3):254–60. https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2022.07.005Szumska J, Grimm D. Boosters for adeno-associated virus (AAV) vector (r)evolution. Cytotherapy. 2023;25(3):254–60. https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2022.07.005Adachi K, Enoki T, Kawano Y, Veraz M, Nakai H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 2014;5:3075. https://doi.org/10.1038/ncomms4075Adachi K, Enoki T, Kawano Y, Veraz M, Nakai H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 2014;5:3075. https://doi.org/10.1038/ncomms4075Marsic D, Govindasamy L, Currlin S, Markusic DM, Tseng YS, Herzog RW, et al. Vector design Tour de Force: integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 2014;22(11):1900–9. https://doi.org/10.1038/mt.2014.139Marsic D, Govindasamy L, Currlin S, Markusic DM, Tseng YS, Herzog RW, et al. Vector design Tour de Force: integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 2014;22(11):1900–9. https://doi.org/10.1038/mt.2014.139Weinmann J, Weis S, Sippel J, Tulalamba W, Remes A, El Andari J, et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nat Commun. 2020;11(1):5432. https://doi.org/10.1038/s41467-020-19230-wWeinmann J, Weis S, Sippel J, Tulalamba W, Remes A, El Andari J, et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nat Commun. 2020;11(1):5432. https://doi.org/10.1038/s41467-020-19230-wGrimm D, Lee JS, Wang L, Desai T, Akache B, Storm TA, et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 2008;82(12):5887–911. https://doi.org/10.1128/jvi.00254-08Grimm D, Lee JS, Wang L, Desai T, Akache B, Storm TA, et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 2008;82(12):5887–911. https://doi.org/10.1128/jvi.00254-08Li H. Minimap2: Pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 2018;34(18):3094–3100. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty191Li H. Minimap2: Pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 2018;34(18):3094–3100. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty191Cock PJA, Antao T, Chang JT, Chapman BA, Cox CJ, Dalke A, et al. Biopython: Freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics. Bioinformatics. 2009;25(11):1422–3. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp163Cock PJA, Antao T, Chang JT, Chapman BA, Cox CJ, Dalke A, et al. Biopython: Freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics. Bioinformatics. 2009;25(11):1422–3. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp163

The authors declare that there are no conflicts of interest present.