biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2024-24-1-32-45biopreparat-558Research ArticleТЕМА НОМЕРА: СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА БИОЛОГИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВISSUE TOPIC: STANDARDISATION AND QUALITY CONTROL OF BIOLOGICALSРазработка и валидация методики определения остаточного белка А в фармацевтических субстанциях терапевтических моноклональных антителDevelopment and validation of an analytical procedure for the determination of residual protein A in active substances of therapeutic monoclonal antibodieshttps://orcid.org/0009-0004-2832-0361НоздринаЕ. В.NozdrinaE. V.

Ноздрина Елена Васильевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Elena V. Nozdrina

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

evnozdrina@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9952-8184МазалевД. А.MazalevD. A.

Мазалев Денис Алексеевич

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Denis A. Mazalev

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

mazalev@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0009-0002-6050-975XРогозинаД. Р.RogozinaD. R.

Рогозина Дарья Романовна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Daria R. Rogozina

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

drrogozina@generium.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4919-3080ЖиводеровС. П.ZhivoderovS. P.

Живодеров Сергей Петрович, канд. вет. наук

ул. Академика Бакулова, д. 1, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Sergey P. Zhivoderov, Cand. Sci. (Vet.)

1 Academician Bakoulov St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

szhivodyorov@vniivvim.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9058-1106ЛягоскинИ. В.LyagoskinI. V.

Лягоскин Иван Владимирович, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

 

Ivan V. Lyagoskin, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

lyagoskin@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6532-7835ШукуровР. Р.ShukurovR. R.

Шукуров Рахим Рахманкулыевич, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Rakhim R. Shukurov, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

Shukurov@ibcgenerium.ruАкционерное общество «ГЕНЕРИУМ»РоссияGENERIUM JSCRussian FederationФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»РоссияFederal Research Center for Virology and MicrobiologyRussian Federation202419022024241Стандартизация и контроль качества биологических лекарственных препаратов3245Copyright © Ноздрина Е.В., Мазалев Д.А., Рогозина Д.Р., Живодеров С.П., Лягоскин И.В., Шукуров Р.Р., 20242024Ноздрина Е.В., Мазалев Д.А., Рогозина Д.Р., Живодеров С.П., Лягоскин И.В., Шукуров Р.Р.Nozdrina E.V., Mazalev D.A., Rogozina D.R., Zhivoderov S.P., Lyagoskin I.V., Shukurov R.R.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/558АКТУАЛЬНОСТЬ

АКТУАЛЬНОСТЬ. При контроле качества препаратов терапевтических моноклональных антител важной задачей является определение остаточного белка А, появление которого связано с вымыванием из носителя в процессе аффинной хроматографической очистки антител. Иммуноферментное определение белка А осложняется эффектом влияния присутствия неродственных соединений (иммуноглобулины) в образце (эффект матрицы), что может приводить к ложноотрицательным результатам анализа. Для повышения эффективности иммуноферментного анализа (ИФА) необходимо разработать этап пробоподготовки образцов, позволяющий необратимо разорвать связь в комплексе «белок А – моноклональное антитело».

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Разработка и валидация аналитической методики иммуноферментного определения остаточного белка А в фармацевтических субстанциях терапевтических моноклональных антител с использованием набора реагентов для ИФА на основе реактивов собственного производства (in-house).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В качестве антигена использовали рекомбинантный белок А. Наработку поликлональных антител к белку А проводили путем иммунизации кур с последующим отбором яиц и выделением из них антител. Специфичные к белку А антитела очищали с применением аффинной хроматографии. Остаточный белок А определяли после предварительной пробоподготовки образцов с помощью сэндвич-ИФА. Валидацию методики проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ОФС.1.1.0012).

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Наработаны, выделены и очищены куриные антитела (IgY) против рекомбинантного белка А. Разработаны условия пробоподготовки и методика для проведения иммуноферментного определения остаточного белка А. Подобраны оптимальные составы буферных растворов, в том числе состав денатурирующего буфера для разрушения комплекса «белок А – моноклональное антитело». Проведена валидация разработанной методики. Измеряемые значения белка А при оценке правильности методики находились в пределах 83–108% от номинального, при оценке межлабораторной прецизионности – в пределах 96–116%, при оценке повторяемости – до 13%. Нижний предел количественного определения составил 10 нг/мл при минимально необходимом разведении 1:10. Аналитическая область методики – от 10 до 40 нг/мл. Методика показала сопоставимые результаты по сравнению с аналогичным набором реагентов иностранного производства.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Разработанная методика определения остаточного белка А c использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа на основе реактивов собственного производства позволяет минимизировать эффект матрицы в препаратах терапевтических моноклональных антител. Применение методики позволит решить проблему импортозамещения и снизить затраты на контроль качества российских иммунобиологических препаратов.

SCIENTIFIC RELEVANCE

SCIENTIFIC RELEVANCE. An important quality-control issue for therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) is the determination of residual protein A leaching from the carrier during the purification of mAbs by affinity chromatography. However, unrelated compounds (immunoglobulins) present in the sample can complicate the immunoenzymatic detection of protein A (matrix effect), potentially leading to false-negative test results. To increase the efficiency of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), it is necessary to develop a sample preparation step that can irreversibly break the bond in the protein A–mAb complex.

AIM

AIM. This study aimed to develop and validate an analytical procedure for the determination of residual protein A in active substances of therapeutic mAbs by ELISA with a test kit comprising in-house reagents.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. Recombinant protein A was used as an antigen. Polyclonal antibodies to protein A were produced by immunising chickens, selecting immunised eggs, and isolating antibodies from these eggs. Protein A-specific antibodies were purified by affinity chromatography. Residual protein A was determined using sandwich ELISA with preliminary sample preparation. The analytical procedure was validated in accordance with the requirements of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation (Validation of Analytical Procedures, OFS.1.1.0012).

RESULTS

RESULTS. The authors obtained, isolated, and purified chicken IgY antibodies to recombinant protein A. The authors selected sample preparation conditions for the determination of residual protein A by ELISA and optimum compositions of buffer solutions, including the composition of a denaturing buffer to disrupt the protein A–mAb complex. The developed analytical procedure was validated. According to the measurements of protein A, the accuracy of the analytical procedure ranged within 83–108% of the nominal value, the interlaboratory precision ranged within 96–116%, and the repeatability was up to 13%. The lower limit of quantitation was 10 ng/mL with a minimum required dilution of 1:10. The analytical range extended from 10 to 40 ng/mL. The analytical procedure showed results comparable to those obtained with a similar test kit from an international manufacturer.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. The developed analytical procedure for the determination of residual protein A by ELISA with a test kit comprising in-house reagents can minimise the matrix effect in therapeutic mAbs. This analytical procedure will alleviate import substitution and reduce quality control costs for Russian immunobiologicals.

белок Аопределение остаточного белка Атерапевтические моноклональные антителакомплекс «белок А – моноклональное антитело»куриные иммуноглобулины IgYаффинная хроматографическая очистка антителиммуноферментный анализвалидация методикиэффект матрицыпробоподготовка образцовprotein Adetermination of residual protein Atherapeutic monoclonal antibodiesmAbprotein A–mAb complexchicken IgY immunoglobulinspurification of antibodies by affinity chromatographyimmunoenzyme assayvalidation of analytical proceduresmatrix effectsample preparationИсследования выполнялись в рамках научно-исследовательской работы АО «ГЕНЕРИУМ»This study was carried out as part of the research work of GENERIUM JSCReferencesSanchez-Trasvina C, Flores-Gatica M, Enriquez-Ochoa D, Rito-Palomares M, Mayolo-Deloisa K. Purification of modified therapeutic proteins available on the market: an analysis of chromatography-based strategies. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:717326. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.717326Sanchez-Trasvina C, Flores-Gatica M, Enriquez-Ochoa D, Rito-Palomares M, Mayolo-Deloisa K. Purification of modified therapeutic proteins available on the market: an analysis of chromatography-based strategies. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:717326. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.717326Mazigi O, Schofield P, Langley DB, Christ D. Protein A superantigen: structure, engineering and molecular basis of antibody recognition. Protein Eng Des Sel. 2019;32(8):359–66. https://doi.org/10.1093/protein/gzz026Mazigi O, Schofield P, Langley DB, Christ D. Protein A superantigen: structure, engineering and molecular basis of antibody recognition. Protein Eng Des Sel. 2019;32(8):359–66. https://doi.org/10.1093/protein/gzz026Wilson LJ, Lewis W, Kucia-Tran R, Bracewell DG. Identification and classification of host cell proteins during biopharmaceutical process development. Biotechnol Prog. 2022;38(1):e3224. https://doi.org/10.1002/btpr.3224Wilson LJ, Lewis W, Kucia-Tran R, Bracewell DG. Identification and classification of host cell proteins during biopharmaceutical process development. Biotechnol Prog. 2022;38(1):e3224. https://doi.org/10.1002/btpr.3224Choe W, Durgannavar TA, Chung SJ. Fc-binding ligands of immunoglobulin G: an overview of high affinity proteins and peptides. Materials (Basel). 2016;9(12):994. https://doi.org/10.3390/ma9120994Choe W, Durgannavar TA, Chung SJ. Fc-binding ligands of immunoglobulin G: an overview of high affinity proteins and peptides. Materials (Basel). 2016;9(12):994. https://doi.org/10.3390/ma9120994Kovacs-Nolan J, Mine Y. Egg yolk antibodies for passive immunity. Annu Rev Food Sci Technol. 2012;3:163–82. https://doi.org/10.1146/annurev-food-022811-101137Kovacs-Nolan J, Mine Y. Egg yolk antibodies for passive immunity. Annu Rev Food Sci Technol. 2012;3:163–82. https://doi.org/10.1146/annurev-food-022811-101137Pereira EPV, van Tilburg MF, Florean EOPT, Guedes MIF. Egg yolk antibodies (IgY) and their applications in human and veterinary health: a review. Int Immunopharmacol. 2019;73:293–303. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2019.05.015Pereira EPV, van Tilburg MF, Florean EOPT, Guedes MIF. Egg yolk antibodies (IgY) and their applications in human and veterinary health: a review. Int Immunopharmacol. 2019;73:293–303. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2019.05.015Amro WA, Al-Qaisi W, Al-Razem F. Production and purification of IgY antibodies from chicken egg yolk. J Genet Eng Biotechnol. 2018;16(1):99–103. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2017.10.003Amro WA, Al-Qaisi W, Al-Razem F. Production and purification of IgY antibodies from chicken egg yolk. J Genet Eng Biotechnol. 2018;16(1):99–103. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2017.10.003Steindl F, Armbruster C, Hahn R, Armbruster C, Katinger HWD. A simple method to quantify staphylococcal protein A in the presence of human or animal IgG in various samples. J Immunol Methods. 2000;235(1–2):61–9. https://doi.org/10.1016/S0022-1759(99)00211-2Steindl F, Armbruster C, Hahn R, Armbruster C, Katinger HWD. A simple method to quantify staphylococcal protein A in the presence of human or animal IgG in various samples. J Immunol Methods. 2000;235(1–2):61–9. https://doi.org/10.1016/S0022-1759(99)00211-2Cruz AR, den Boer MA, Strasser J, Zwarthoff SA, Beurskens FJ, de Haas CJC, et al. Staphylococcal protein A inhibits complement activation by interfering with IgG hexamer formation. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118(7):e2016772118. https://doi.org/10.1073/pnas.2016772118Cruz AR, den Boer MA, Strasser J, Zwarthoff SA, Beurskens FJ, de Haas CJC, et al. Staphylococcal protein A inhibits complement activation by interfering with IgG hexamer formation. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118(7):e2016772118. https://doi.org/10.1073/pnas.2016772118Liu FF, Huang B, Dong X-Y, Sun Y. Molecular basis for the dissociation dynamics of protein A-immunoglobulin G1 complex. PLoS One. 2013;8(6):e66935. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066935Liu FF, Huang B, Dong X-Y, Sun Y. Molecular basis for the dissociation dynamics of protein A-immunoglobulin G1 complex. PLoS One. 2013;8(6):e66935. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066935Ren D, Darlucio MR, Chou JH. Development of a multi-product leached protein A assay for bioprocess samples containing recombinant human monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2011;366(1–2):20–7. https://doi.org/10.1016/j.jim.2011.02.003Ren D, Darlucio MR, Chou JH. Development of a multi-product leached protein A assay for bioprocess samples containing recombinant human monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2011;366(1–2):20–7. https://doi.org/10.1016/j.jim.2011.02.003

The authors declare that there are no conflicts of interest present.