Писарев Владимир Викторович, канд. хим. наук
ул. 5-я Кабельная, д. 2-Б, стр. 1, Москва, 111024
Vladimir V. Pisarev, Cand. Sci. (Chem.)
B bld. 1, 5th Kabelnaya St., Moscow 111024
Иванов Андрей Владимирович, канд. биол. наук
ул. 5-я Кабельная, д. 2-Б, стр. 1, Москва, 111024
Andrei V. Ivanov, Cand. Sci. (Biol.)
B bld. 1, 5th Kabelnaya St., Moscow 111024
ВВЕДЕНИЕ. Трастузумаб — препарат на основе рекомбинантных гуманизированных моноклональных антител к HER2, показан для таргетной терапии HER2+ рака молочной железы. Применение трастузумаба стало рутинной практикой в лечении рака и позволяет повысить общую выживаемость пациенток. Однако в ряде случаев трастузумаб способен вызывать появление антилекарственных антител (АЛА), снижающих эффективность таргетной терапии. По этой причине своевременное выявление АЛА в сыворотке крови необходимо для возможной коррекции терапии.
ЦЕЛЬ. Разработка и валидация методики полуколичественного определения общих АЛА к трастузумабу в биологических жидкостях методом твердофазного иммуноферментного анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Тест-система представлена в виде классического ИФА-набора, в состав которого входят 96-луночный планшет с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок трастузумабом, раствор вторичных антител (трастузумаб, конъюгированный с пероксидазой хрена), субстратный раствор (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) и стоп-раствор. Оптическую плотность определяли с помощью планшетного фотометра при длине волны 450 нм. Растворы для контроля качества готовили путем разведения моноклональных антител к трастузумабу в буферном растворе, содержащем сыворотку крови человека.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Наименьшая определяемая концентрация АЛА составила 2 нг/мл при 2-кратном значении показателя минимального необходимого разведения. Методика устойчива к наличию 116 нг/мл трастузумаба при уровне 16 нг/мл АЛА и 1000 нг/мл трастузумаба при уровне 100 нг/мл АЛА. Доказана специфичность, селективность и прецизионность методики внутри одной аналитической серии, а также между разными сериями. Вероятность «хук»-эффекта от избыточных концентраций АЛА исключается в диапазоне от 0,16 до 640 нг/мл. Продемонстрирована краткосрочная стабильность АЛА в образцах в течение 6 ч при комнатной температуре, долгосрочная стабильность при хранении образцов при минус 70 °С в течение 90 сут и стабильность при трех циклах замораживания до минус 70 °С (по 12 ч) и оттаивания.
ВЫВОДЫ. Установленные параметры представленной тест-системы свидетельствуют о возможности ее применения для выявления антилекарственных антител к трастузумабу в биологических жидкостях при таргетной терапии.
INTRODUCTION. Trastuzumab is a recombinant humanised monoclonal antibody against human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) approved as targeted therapy for patients with HER2-positive breast cancer. Improving overall patient survival, trastuzumab has become a standard of care in cancer treatment. However, trastuzumab can induce anti-drug antibodies (ADAs), which can reduce the effectiveness of treatment. Therefore, timely detection of serum ADAs is necessary for potential treatment adjustment.
AIM. This study aimed to develop and validate an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for semiquantitative determination of all-class anti-trastuzumab ADAs.
MATERIALS AND METHODS. The presented test system is a classic ELISA kit comprising a 96-well plate with trastuzumab immobilised on the inner surface of the wells, a solution of secondary antibody (trastuzumab conjugated with horseradish peroxidase), a substrate solution (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine), and a stop solution. The authors determined the optical density at 450 nm using a microplate photometer. Quality control solutions were prepared by diluting monoclonal antibodies against trastuzumab with a buffer containing human serum.
RESULTS. The limit of quantification for ADAs is 2 ng/mL, and the minimum required dilution is 1:2. The assay is tolerant to trastuzumab concentrations of 116 ng/mL and 1000 ng/mL and can detect ADA levels of 16 ng/mL and 100 ng/mL, respectively, in the presence of trastuzumab. The analytical procedure provides results with acceptable specificity, selectivity, and within-run and between-run precision. The assay can measure ADA concentrations ranging from 640 ng/mL to 0.16 ng/mL without exhibiting the hook effect from excess ADA levels. ADAs are stable for 6 hours at room temperature, 90 days at −70 °C, and three freeze–thaw cycles with 12-hour periods at −70 °C.
CONCLUSIONS. The test system parameters established in this study confirm the applicability of the system for detecting ADAs against trastuzumab in biological fluids during targeted therapy.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.