biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2024-24-2-200-214biopreparat-549Research ArticleТЕМА НОМЕРА: ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫISSUE TOPIC: ADVANCED THERAPY MEDICINAL PRODUCTSРазработка стандартного образца пустых капсидов рекомбинантного аденоассоциированного вируса для контроля качества препаратов генной терапииDevelopment of recombinant adeno-associated virus empty capsids as a reference standard for quality control of gene therapy productshttps://orcid.org/0009-0009-1826-4091ТумаевА. В.TumaevA. V.

Тумаев Артем Валериевич

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Artem V. Tumaev

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

mrb43995@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0005-2201-2082ВолошинД. Ю.VoloshinD. Yu.

Волошин Данил Юрьевич

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Danil Yu. Voloshin

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

voloshin.dy@talantiuspeh.ruhttps://orcid.org/0009-0007-1421-8931БердинскихЕ. С.BerdinskikhE. S.

Бердинских Евгений Сергеевич

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Evgenii S. Berdinskikh

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

berdinskih.es@talantiuspeh.ruhttps://orcid.org/0009-0004-0252-3267СахибгараеваЕ. Л.SakhibgaraevaE. L.

Сахибгараева Елена Любомировна

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Elena L. Sakhibgaraeva

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

sahibgaraeva.el@talantiuspeh.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4008-8433ГоловинЕ. В.GolovinE. V.

Головин Евгений Валерьевич

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Evgenii V. Golovin

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

golovin.ev@siriusuniversity.ruhttps://orcid.org/0009-0006-9282-3582СубчеваЕ. Н.SubchevaE. N.

Субчева Елена Николаевна

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Elena N. Subcheva

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

subcheva.en@talantiuspeh.ruhttps://orcid.org/0009-0001-3726-2261ВасильеваО. О.VasilevaO. O.

Васильева Ольга Олеговна

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Olga O. Vasileva

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

vasileva.oo@talantiuspeh.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8190-0710ГалиеваА. А.GalievaA. A.

Галиева Алима Абдураимовна

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Alima A. Galieva

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

galieva.aa@talantiuspeh.ruhttps://orcid.org/0009-0006-5528-150XЧувашовА. А.ChuvashovA. A.

Чувашов Антон Андреевич

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Anton A. Chuvashov

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

chuvashov.aa@talantiuspeh.ruhttps://orcid.org/0009-0003-1817-9256НовиковаЕ. С.NovikovaE. S.

Новикова Екатерина Сергеевна

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Ekaterina S. Novikova

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

novikova.es@talantiuspeh.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6391-5182КарабельскийА. В.KarabelskyA. V.

Карабельский Александр Владимирович, канд. биол. наук

Олимпийский проспект, д. 1, пгт. Сириус, Краснодарский край, 354340

Alexander V. Karabelsky, Cand. Sci. (Biol.)

1 Olimpiysky Ave, Sirius urban-type settlement, Krasnodar Region 354340

karabelskiy.av@siriusuniversity.ruАвтономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Научно-технологический университет «Сириус»РоссияSirius University of Science and TechnologyRussian Federation202403062024242Высокотехнологичные лекарственные препараты200214Copyright © Тумаев А.В., Волошин Д.Ю., Бердинских Е.С., Сахибгараева Е.Л., Головин Е.В., Субчева Е.Н., Васильева О.О., Галиева А.А., Чувашов А.А., Новикова Е.С., Карабельский А.В., 20242024Тумаев А.В., Волошин Д.Ю., Бердинских Е.С., Сахибгараева Е.Л., Головин Е.В., Субчева Е.Н., Васильева О.О., Галиева А.А., Чувашов А.А., Новикова Е.С., Карабельский А.В.Tumaev A.V., Voloshin D.Y., Berdinskikh E.S., Sakhibgaraeva E.L., Golovin E.V., Subcheva E.N., Vasileva O.O., Galieva A.A., Chuvashov A.A., Novikova E.S., Karabelsky A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/549

ВВЕДЕНИЕ. При фармацевтической разработке российских препаратов генной терапии на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) необходимым этапом является создание стандартных образцов (СО), которые используются на протяжении всего цикла разработки препарата, а также установление стабильности СО при хранении. В качестве материала для СО AAV 9 серотипа (AAV9) может выступать препарат пустых капсидов AAV9.ЦЕЛЬ. Разработка методик оценки физико-химических показателей качества для характеристики стандартного образца пустых капсидов AAV9 и исследование его стабильности при хранении.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Наработку СО пустых капсидов AAV9 проводили в суспензионных клетках HEK293 с использованием бессывороточной среды при оптимизированных параметрах трансфекции с последующим осветлением, концентрированием, хроматографической очисткой AAV9 на аффинном сорбенте (AAVX) и диафильтрацией. Для анализа образцов применяли электрофорез, трансмиссионную электронную микроскопию, иммуноферментный анализ (ИФА), эксклюзионную хроматографию, динамическое светорассеяние, спектрофотометрию и биослойную интерферометрию. Определение концентрации капсидов проводили методом ИФА. Для разработки методов оценки физического титра использовали СО AAV с известным титром. При исследовании стабильности СО хранили при –80 °C в течение 9 мес.РЕЗУЛЬТАТЫ. Наработанный СО AAV9 обладал высокой степенью чистоты по результатам эксклюзионной хроматографии — содержание мономеров вирусных капсидов составляло не менее 98%. С использованием методов динамического светорассеяния, эксклюзионной хроматографии и электронной микроскопии показано отсутствие агрегатов в образце. Установлена стабильность полученного СО пустых капсидов AAV9 в течение 9 мес. Показано, что при определении физического титра СО пустых капсидов AAV9 оптимальными для рутинного анализа качества являются методы динамического рассеяния света и спектрофотометрии; метод биослойной интерферометрии рекомендуется для регулярного анализа. Определенные тремя указанными методами значения титра вирусных частиц варьировали от 1,48×10¹³ до 5,6×10¹³.ВЫВОДЫ. Разработан стандартный образец пустых капсидов AAV9, который может быть пригоден для контроля качества препаратов генной терапии на основе AAV9.

INTRODUCTION. The development of adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy products in Russia requires establishing reference standards, which are used throughout the pharmaceutical development cycle, and monitoring their stability during the storage period. A preparation of empty capsids of AAV serotype 9 (AAV9) is an appropriate material for a reference standard for empty AAV9 capsids (AAV9 RS).AIM. This study aimed to develop analytical procedures to evaluate the AAV9 RS physicochemical quality parameters for its characterisation and to study its storage stability.MATERIALS AND METHODS. Empty AAV9 capsids were produced in HEK293 suspension culture using serum-free medium and optimised transfection parameters. The next steps involved AAV9 clarification, concentration, and purification by affinity chromatography with AAVx resin and diafiltration. The analysis of AAV9 samples used electrophoresis, transmission electron microscopy, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), size-exclusion chromatography, dynamic light scattering, spectrophotometry, and bio-layer interferometry. The concentration of capsids was measured by ELISA. Analytical procedures for physical titre determination were developed using an AAV9 standard with a known physical titre. The stability study of the AAV9 RS involved storage at –80 °C for 9 months.RESULTS. Size-exclusion chromatography demonstrated the high purity of the established AAV9 RS, with at least 98% content of the viral capsid monomer. Dynamic light scattering, size-exclusion chromatography, and electron microscopy confirmed that the AAV9 RS was free of aggregates. The stability study showed that the AAV9 RS remained stable for 9 months. Dynamic light scattering and spectrophotometry were deemed optimal methods for routine quality analysis measuring the AAV9 RS physical titre, and bio-layer interferometry was recommended for regular analysis. The viral particle titres determined by these methods ranged from 1.48×1013 to 5.6×1013.CONCLUSIONS. The AAV9 RS established in this study is suitable for quality control of AAV9-based gene therapy products.

аденоассоциированный вирусAAVпустой капсидгенная терапиягенотерапевтический преператфармацевтическая разработкаметоды контроля качествастандартный образецHEK293аффинная хроматографияфизический титр капсидовстабильность стандартного образцаadeno-associated virusAAVempty capsidgene therapygene therapy productpharmaceutical developmentquality control methodsreference standardHEK293affinity chromatographyphysical capsid titrereference standard stabilityФинансирование проекта осуществлялось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-10-2021-093; проект GTH-RND-2112).The study was funded by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (Agreement No. 075-10-2021-093, Research Project No. GTH-RND-2112).ReferencesMinskaia E, Galieva A, Egorov AD, Karabelsky AV. Viral vectors in gene replacement therapy. Biochemistry (Mosc). 2023;88(12):2157–78. https://doi.org/10.1134/s0006297923120179Minskaia E, Galieva A, Egorov AD, Karabelsky AV. Viral vectors in gene replacement therapy. Biochemistry (Mosc). 2023;88(12):2157–78. https://doi.org/10.1134/s0006297923120179Mendell JR, Al-Zaidy S, Shell R, Arnold WD, RodinoKlapac LR, Prior TW, et al. Single-dose gene-replacement therapy for spinal muscular atrophy. N Engl J Med. 2017;377(18):1713–22. https://doi.org/10.1056/nejmoa1706198Mendell JR, Al-Zaidy S, Shell R, Arnold WD, RodinoKlapac LR, Prior TW, et al. Single-dose gene-replacement therapy for spinal muscular atrophy. N Engl J Med. 2017;377(18):1713–22. https://doi.org/10.1056/nejmoa1706198Coovert DD, Le TT, McAndrew PE, Strasswimmer J, Crawford TO, Mendell JR, et al. The survival motor neuron protein in spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 1997;6(8):1205–14. https://doi.org/10.1093/hmg/6.8.1205Coovert DD, Le TT, McAndrew PE, Strasswimmer J, Crawford TO, Mendell JR, et al. The survival motor neuron protein in spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 1997;6(8):1205–14. https://doi.org/10.1093/hmg/6.8.1205Wang C, Mulagapati SHR, Chen Z, Du J, Zhao X, Xi G, et al. Developing an anion exchange chromatography assay for determining empty and full capsid contents in AAV6.2. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019;15:257–63. https://doi.org/10.1016/J.OMTM.2019.09.006Wang C, Mulagapati SHR, Chen Z, Du J, Zhao X, Xi G, et al. Developing an anion exchange chromatography assay for determining empty and full capsid contents in AAV6.2. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019;15:257–63. https://doi.org/10.1016/J.OMTM.2019.09.006Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680–5. https://doi.org/10.1038/227680A0Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680–5. https://doi.org/10.1038/227680A0Hofmann A, Clokie S, eds. Wilson and Walker’s principles and techniques of biochemistry and molecular biology. 8th ed. Griffith University; 2018. https://doi.org/10.1017/9781316677056Hofmann A, Clokie S, eds. Wilson and Walker’s principles and techniques of biochemistry and molecular biology. 8th ed. Griffith University; 2018. https://doi.org/10.1017/9781316677056Petersen RL. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 2017;7(4):49. https://doi.org/10.3390/BIOS7040049Petersen RL. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 2017;7(4):49. https://doi.org/10.3390/BIOS7040049Рябова ЕИ, Деркаев АА, Есмагамбетов ИБ, Щебляков ДВ, Довгий МА, Бырихина ДВ и др. Сравнение различных технологий получения рекомбинантного аденоассоциированного вируса в лабораторном масштабе. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2021;21(4):266–78. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2021-21-4-266-278Ryabova EI, Derkaev AA, Esmagambetov IB, Shcheblyakov DV, Dovgiy MA, Byrikhina DV, et al. Comparison of different technologies for producing recombinant adeno-associated virus on a laboratory scale. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2021;21(4):266–78 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2021-21-4-266-278Grieger JC, Soltys SM, Samulski RJ. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 2016;24(2):287. https://doi.org/10.1038/MT.2015.187Grieger JC, Soltys SM, Samulski RJ. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 2016;24(2):287. https://doi.org/10.1038/MT.2015.187Terova O, Soltys S, Hermans P, De Rooij J, Detmers F. Overcoming downstream purification challenges for viral vector manufacturing: enabling advancement of gene therapies in the clinic. Cell and Gene Therapy Insights. 2018;4(2):101–11. https://doi.org/10.18609/CGTI.2018.017Terova O, Soltys S, Hermans P, De Rooij J, Detmers F. Overcoming downstream purification challenges for viral vector manufacturing: enabling advancement of gene therapies in the clinic. Cell and Gene Therapy Insights. 2018;4(2):101–11. https://doi.org/10.18609/CGTI.2018.017Florea M, Nicolaou F, Pacouret S, Zinn EM, Sanmiguel J, Andres-Mateos E, et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023;28:146–59. https://doi.org/10.1016/J.OMTM.2022.12.009Florea M, Nicolaou F, Pacouret S, Zinn EM, Sanmiguel J, Andres-Mateos E, et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023;28:146–59. https://doi.org/10.1016/J.OMTM.2022.12.009Richert-Pöggeler KR, Franzke K, Hipp K, Kleespies RG. Electron microscopy methods for virus diagnosis and high-resolution analysis of viruses. Front Microbiol. 2019;9:3255. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.03255Richert-Pöggeler KR, Franzke K, Hipp K, Kleespies RG. Electron microscopy methods for virus diagnosis and high-resolution analysis of viruses. Front Microbiol. 2019;9:3255. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.03255Yang TY, Braun M, Lembke W, McBlane F, Kamerud J, DeWall S, et al. Immunogenicity assessment of AAV-based gene therapies: an IQ consortium industry white paper. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022;26:471–94. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022.07.018Yang TY, Braun M, Lembke W, McBlane F, Kamerud J, DeWall S, et al. Immunogenicity assessment of AAV-based gene therapies: an IQ consortium industry white paper. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022;26:471–94. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022.07.018Deb PK, Kokaz SF, Abed SN, Paradkar A, Tekade RK. Chapter 6. Pharmaceutical and biomedical applications of polymers. In: Tekade RK, ed. Basic fundamentals of drug delivery. A volume in advances in pharmaceutical product development and research. Amsterdam: Elsevier; 2019. P. 203–67. https://doi.org/10.1016/C2018-0-03215-6Deb PK, Kokaz SF, Abed SN, Paradkar A, Tekade RK. Chapter 6. Pharmaceutical and biomedical applications of polymers. In: Tekade RK, ed. Basic fundamentals of drug delivery. A volume in advances in pharmaceutical product development and research. Amsterdam: Elsevier; 2019. P. 203–67. https://doi.org/10.1016/C2018-0-03215-6Sommer JM, Smith PH, Parthasarathy S, Isaacs J, Vijay S, Kieran, et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 2003;7(1):122–8. https://doi.org/10.1016/S1525-0016(02)00019-9Sommer JM, Smith PH, Parthasarathy S, Isaacs J, Vijay S, Kieran, et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 2003;7(1):122–8. https://doi.org/10.1016/S1525-0016(02)00019-9Grimm D, Storm TA, Hammami N, Graf M, Kay MA, Maheshri N, et al. 899. Directed evolution of the AAV-2 capsid yields novel mutants. Mol Ther. 2003;7(5):S347–8. https://doi.org/10.1016/s1525-0016(16)41341-9Grimm D, Storm TA, Hammami N, Graf M, Kay MA, Maheshri N, et al. 899. Directed evolution of the AAV-2 capsid yields novel mutants. Mol Ther. 2003;7(5):S347–8. https://doi.org/10.1016/s1525-0016(16)41341-9Ульянова КВ, Казаров АА, Пантюшенко МС, Оленев АА, Лягоскин ИВ, Симонов ВМ. Разработка и валидация методики определения концентрации антитела человека, блокирующего связывание PD-1 с лигандами, в сыворотке крови яванского макака методом биослойной интерферометрии. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;20(4):257–67.Ulyanova KV, Kazarov AA, Pantyushenko MS, Olenev AA, Lyagoskin IV, Simonov VM. Development and validation of a biolayer interferometry method for determination of human anti-PD-1 monoclonal antibody concentration in cynomolgus serum. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2020;20(4):257–67 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-4-257-267

The authors declare that there are no conflicts of interest present.