biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2024-24-1-103-116biopreparat-537Research ArticleБАКТЕРИОФАГИBACTERIOPHAGESВыделение новых бактериофагов Actinomyces oris и Aggregatibacter actinomycetemcomitans и исследование их биологических характеристик in vitroIsolation of novel Actinomyces oris and Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteriophages and study of their biological characteristics in vitrohttps://orcid.org/0000-0001-8280-4341КочетоваТ. А.KochetovaT. A.

Кочетова Татьяна Андреевна

Кисельный Нижний пер., д.5/23, стр.1, Москва, 107031

Tatiana A. Kochetova

5/23 Bldg.1, Nizhny Kiselny Ln., Moscow 107031

kochetova@micromir.biohttps://orcid.org/0000-0002-0459-7479ЮскевичВ. В.YuskevichV. V.

Юскевич Виктория Викторовна, канд. биол. наук

Кисельный Нижний пер., д.5/23, стр.1, Москва, 107031

Victoria V. Yuskevich, Cand. Sci. (Biol.)

5/23 Bldg.1, Nizhny Kiselny Ln., Moscow 107031

v.yuskevich@micromir.biohttps://orcid.org/0000-0001-7947-1128ЗурабовФ. М.ZurabovF. M.

Зурабов Федор Михайлович

Кисельный Нижний пер., д.5/23, стр.1, Москва, 107031

Fedor M. Zurabov

5/23 Bldg.1, Nizhny Kiselny Ln., Moscow 107031

fmzurabov@micromir.biohttps://orcid.org/0000-0002-7711-7958СадиковаГ. Т.SadykovaG. T.

Садикова Гульнур Тахавиевна

Кисельный Нижний пер., д.5/23, стр.1, Москва, 107031

Gulnur T. Sadykova

5/23 Bldg.1, Nizhny Kiselny Ln., Moscow 107031

gulnurs.5959@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0004-8857-9519МедведевП. В.MedvedevP. V.

Медведев Павел Витальевич

Кисельный Нижний пер., д.5/23, стр.1, Москва, 107031

Pavel V. Medvedev

5/23 Bldg.1, Nizhny Kiselny Ln., Moscow 107031

p.medvedev@micromir.biohttps://orcid.org/0000-0002-9630-1945ПоповаВ. М.PopovaV. M.

Попова Валентина Михайловна, канд. мед. наук

Кисельный Нижний пер., д.5/23, стр.1, Москва, 107031

Valentina M. Popova, Cand. Sci. (Med.)

5/23 Bldg.1, Nizhny Kiselny Ln., Moscow 107031

popovavm9@yandex.ruООО НПЦ "Микромир"РоссияResearch and Production Centre Micromir, LLCRussian Federation202401032024241Стандартизация и контроль качества биологических лекарственных препаратов103116Copyright © Кочетова Т.А., Юскевич В.В., Зурабов Ф.М., Садикова Г.Т., Медведев П.В., Попова В.М., 20242024Кочетова Т.А., Юскевич В.В., Зурабов Ф.М., Садикова Г.Т., Медведев П.В., Попова В.М.Kochetova T.A., Yuskevich V.V., Zurabov F.M., Sadykova G.T., Medvedev P.V., Popova V.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/537АКТУАЛЬНОСТЬ

АКТУАЛЬНОСТЬ. В связи с увеличением числа случаев возникновения инфекций пародонта, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами бактерий Actinomyces oris и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, способными формировать биопленки в полости рта, и недостаточной эффективностью противомикробных препаратов в борьбе с биопленками, актуальной задачей представляется выделение бактериофагов, активных в отношении данных бактерий.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Выделение бактериофагов, активных в отношении Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Actinomyces oris, изучение их биологических свойств и подбор оптимальных параметров культивирования системы «фаг-клетка» для получения чистых линий бактериофагов с высокими титрами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Бактериофаги выделяли из биообразцов слюны, зубного налета и содержимого пародонтального кармана и определяли их характеристики: оптимальные значения множественности инфекции, время культивирования системы «фаг-клетка», устойчивость к различным температурам и рН, стабильность при хранении. Морфологию фагов изучали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Морфологию негативных колоний, литическую активность, спектр хозяев и специфичность оценивали, используя спот-тестирование и метод Грациа. В работе использовали бактерии из коллекции штаммов НПЦ «Микромир».

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Выделены и изучены биологические свойства трех новых изолятов бактериофагов, активных в отношении A. oris (vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35), и бактериофага, активного в отношении Ag. actinomycetemcomitans (vB_AacS_1/Dc-1). Фаги бактерий A. oris отнесены к подовирусам, а бактериофаг vB_AacS_1/Dc-1 – к сифовирусам. Фаги образуют полностью прозрачные бляшки округлой формы без ореола, диаметром от 0,8±0,1 до 4,0±0,2 мм. Установлено, что для получения чистых линий фагов с максимальными значениями титра оптимальными являются следующие параметры: значение множественности инфекции – 0,1–10, время культивирования системы «фаг-клетка» – 8–12 ч. Выявлена способность бактериофагов A. oris лизировать штаммы Actinomyces naeslundii. Из 15 исследуемых штаммов A. оris, бактериофаги vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35 лизировали 10, 8 и 12 бактериальных штаммов соответственно, а изолят фага vB_AacS_1/Dc-1 проявлял литическую активность в отношении обоих тестируемых штаммов Ag. actinomycetemcomitans. Исследуемые фаги продемонстрировали стабильность при абиотическом стрессе и длительном хранении.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Выделены три новых бактериофага, активных в отношении A. oris, и один бактериофаг, активный в отношении Ag. actinomycetemcomitans, а также изучены их биологические свойства. Выделенные бактериофаги являются перспективными для дальнейших научных исследований на клинических штаммах, а также для проведения полногеномного секвенирования.

SCIENTIFIC RELEVANCE

SCIENTIFIC RELEVANCE. The incidence of periodontal infections with antibiotic-resistant strains of Actinomyces oris and Aggregatibacter actinomycetemcomitans capable of forming biofilms in the oral cavity is increasing, and the effectiveness of antimicrobials against biofilms is insufficient. Therefore, the isolation of bacteriophages active against A. oris and Ag. actinomycetemcomitans is an urgent task.

AIM

AIM. This study aimed to isolate bacteriophages active against A. oris and Ag. actinomycetemcomitans, study their biological properties, and select optimum culture conditions providing pure lines and high titres of bacteriophages.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. Bacteriophages were isolated from biosamples of saliva, dental plaque, and periodontal pocket contents. The study determined bacteriophage characteristics, including the optimum multiplicity of infection, phage–cell system cultivation time, resistance to various temperatures and pH, and storage stability. Bacteriophage morphology was studied using transmission electron microscopy. Negative colony morphology, lytic activity, host range, and specificity were assessed using spot testing and the Gratia method. Bacterial strains were obtained from the strain collection of the Micromir research and production centre.

RESULTS

RESULTS. The authors isolated and studied 3 novel bacteriophages active against A. oris (vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, and vB_AorP_3/Bl-35) and 1 bacteriophage active against Ag. actinomycetemcomitans (vB_AacS_1/Dc-1). The A. oris bacteriophages were classified as podoviruses, and the vB_AacS_1/Dc-1 bacteriophage was classified as a siphovirus. The phages formed completely transparent round plaques without a halo, with a diameter ranging from 0.8±0.1 to 4.0±0.2 mm. The optimum parameters established to obtain pure phages with maximum titres included a multiplicity of infection of 0,1–10 and phage–cell system cultivation time of 8–12 hours. The study demonstrated the ability of A. oris bacteriophages to lyse Actinomyces naeslundii strains. Of the 15 A. oris bacteriophage strains studied, vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, and vB_AorP_3/Bl-35 lysed 10, 8, and 12 bacterial strains, respectively. The vB_AacS_1/Dc-1 phage isolate exhibited lytic activity against both tested strains of Ag. actinomycetemcomitans. The studied phages demonstrated stability under abiotic stress and long-term storage conditions.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. The authors isolated 3 novel bacteriophages active against A. oris and 1 bacteriophage active against Ag. actinomycetemcomitans and studied their biological properties. The isolated bacteriophages are promising as candidates for further research using clinical strains and whole-genome sequencing.

бактериофагиActinomyces orisAggregatibacter actinomycetemcomitansзаболевания пародонтапародонтальные инфекциибиопленкафаготерапияфагопрофилактикамножественность инфекцииMOIлитическая активностьbacteriophagesActinomyces orisAggregatibacter actinomycetemcomitansperiodontal diseasesperiodontal infectionsbiofilmphage therapyphage prophylaxismultiplicity of infectionMOIlytic activityРабота выполнена без спонсорской поддержкиThe study was performed without external fundingReferencesPeriasamy S, Kolenbrander PE. Central role of the early colonizer Veillonella sp. in establishing multispecies biofilm communities with initial, middle, and late colonizers of enamel. J Bacteriol. 2010;192(12):2965–72. https://doi.org/10.1128/JB.01631-09Periasamy S, Kolenbrander PE. Central role of the early colonizer Veillonella sp. in establishing multispecies biofilm communities with initial, middle, and late colonizers of enamel. J Bacteriol. 2010;192(12):2965–72. https://doi.org/10.1128/JB.01631-09Wu C, Mishra A, Reardon ME, Huang IH, Counts SC, Das A, Ton-That H. Structural determinants of Actinomyces sortase SrtC2 required for membrane localization and assembly of type 2 fimbriae for interbacterial coaggregation and oral biofilm formation. J Bacteriol. 2012;194(10):2531–9. https://doi.org/10.1128/JB.00093-12Wu C, Mishra A, Reardon ME, Huang IH, Counts SC, Das A, Ton-That H. Structural determinants of Actinomyces sortase SrtC2 required for membrane localization and assembly of type 2 fimbriae for interbacterial coaggregation and oral biofilm formation. J Bacteriol. 2012;194(10):2531–9. https://doi.org/10.1128/JB.00093-12Sterzenbach T, Helbig R, Hannig C, Hannig M. Bioadhesion in the oral cavity and approaches for biofilm management by surface modifications. Clin Oral Investig. 2020;24(12):4237–60. https://doi.org/10.1007/s00784-020-03646-1Sterzenbach T, Helbig R, Hannig C, Hannig M. Bioadhesion in the oral cavity and approaches for biofilm management by surface modifications. Clin Oral Investig. 2020;24(12):4237–60. https://doi.org/10.1007/s00784-020-03646-1Das V, Vinod V, Biswas L, Kumar A, Biswas R. An update on possible alternative therapeutics for future periodontal disease management. J Appl Microbiol. 2023;134(1):lxac039. https://doi.org/10.1093/jambio/lxac039Das V, Vinod V, Biswas L, Kumar A, Biswas R. An update on possible alternative therapeutics for future periodontal disease management. J Appl Microbiol. 2023;134(1):lxac039. https://doi.org/10.1093/jambio/lxac039Mombelli A. Microbial colonization of the periodontal pocket and its significance for periodontal therapy. Periodontol 2000. 2018;76(1):85–96. https://doi.org/10.1111/prd.12147Mombelli A. Microbial colonization of the periodontal pocket and its significance for periodontal therapy. Periodontol 2000. 2018;76(1):85–96. https://doi.org/10.1111/prd.12147Szafrański SP, Winkel A, Stiesch M. The use of bacteriophages to biocontrol oral biofilms. J Biotechnol. 2017;250:29–44. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.01.002Szafrański SP, Winkel A, Stiesch M. The use of bacteriophages to biocontrol oral biofilms. J Biotechnol. 2017;250:29–44. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.01.002Tagliaferri TL, Jansen M, Horz HP. Fighting pathogenic bacteria on two fronts: phages and antibiotics as combined strategy. Front Cell Infect Microbiol. 2019;9:22. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00022Tagliaferri TL, Jansen M, Horz HP. Fighting pathogenic bacteria on two fronts: phages and antibiotics as combined strategy. Front Cell Infect Microbiol. 2019;9:22. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00022Łusiak-Szelachowska M, Weber-Dąbrowska B, Górski A. Bacteriophages and lysins in biofilm control. Virol Sin. 2020;35(2):125–33. https://doi.org/10.1007/s12250-019-00192-3Łusiak-Szelachowska M, Weber-Dąbrowska B, Górski A. Bacteriophages and lysins in biofilm control. Virol Sin. 2020;35(2):125–33. https://doi.org/10.1007/s12250-019-00192-3Suzuki I, Shimizu T, Senpuku H. Role of SCFAs for fimbrillin-dependent biofilm formation of Actinomyces oris. Microorganisms. 2018;6(4):114. https://doi.org/10.3390/microorganisms6040114Suzuki I, Shimizu T, Senpuku H. Role of SCFAs for fimbrillin-dependent biofilm formation of Actinomyces oris. Microorganisms. 2018;6(4):114. https://doi.org/10.3390/microorganisms6040114Mishra A, Wu C, Yang J, Cisar JO, Das A, Ton-That H. The Actinomyces oris type 2 fimbrial shaft FimA mediates co-aggregation with oral streptococci, adherence to red blood cells and biofilm development. Mol Microbiol. 2010;77(4):841–54. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2010.07252.xMishra A, Wu C, Yang J, Cisar JO, Das A, Ton-That H. The Actinomyces oris type 2 fimbrial shaft FimA mediates co-aggregation with oral streptococci, adherence to red blood cells and biofilm development. Mol Microbiol. 2010;77(4):841–54. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2010.07252.xSanchez BC, Chang C, Wu C, Tran B, Ton-That H. Electron transport chain is biochemically linked to pilus assembly required for polymicrobial interactions and biofilm formation in the gram-positive actinobacterium Actinomyces oris. mBio. 2017;8(3):e00399-17. https://doi.org/10.1128/mBio.00399-17Sanchez BC, Chang C, Wu C, Tran B, Ton-That H. Electron transport chain is biochemically linked to pilus assembly required for polymicrobial interactions and biofilm formation in the gram-positive actinobacterium Actinomyces oris. mBio. 2017;8(3):e00399-17. https://doi.org/10.1128/mBio.00399-17Kachlany SC. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin: from threat to therapy. J Dent Res. 2010;89(6):561–70. https://doi.org/10.1177/0022034510363682Kachlany SC. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin: from threat to therapy. J Dent Res. 2010;89(6):561–70. https://doi.org/10.1177/0022034510363682Danforth DR, Tang-Siegel G, Ruiz T, Mintz KP. A nonfimbrial adhesin of Aggregatibacter actinomycetemcomitans mediates biofilm biogenesis. Infect Immun. 2018;87(1):e00704-18. https://doi.org/10.1128/IAI.00704-18Danforth DR, Tang-Siegel G, Ruiz T, Mintz KP. A nonfimbrial adhesin of Aggregatibacter actinomycetemcomitans mediates biofilm biogenesis. Infect Immun. 2018;87(1):e00704-18. https://doi.org/10.1128/IAI.00704-18Nambu T, Mashimo C, Maruyama H, Taniguchi M, Huang Y, Takigawa H, et al. Complete genome sequence of Actinomyces oris strain K20, isolated from an oral apical lesion. Microbiol Resour Announc. 2022;11(8):e0054122. https://doi.org/10.1128/mra.00541-22Nambu T, Mashimo C, Maruyama H, Taniguchi M, Huang Y, Takigawa H, et al. Complete genome sequence of Actinomyces oris strain K20, isolated from an oral apical lesion. Microbiol Resour Announc. 2022;11(8):e0054122. https://doi.org/10.1128/mra.00541-22Phichaphop C, Apiwattanakul N, Wanitkun S, Boonsathorn S. Bacterial endocarditis caused by Actinomyces oris: first reported case and literature review. J Investig Med High Impact Case Rep. 2020;8:2324709620910645. https://doi.org/10.1177/2324709620910645Phichaphop C, Apiwattanakul N, Wanitkun S, Boonsathorn S. Bacterial endocarditis caused by Actinomyces oris: first reported case and literature review. J Investig Med High Impact Case Rep. 2020;8:2324709620910645. https://doi.org/10.1177/2324709620910645Tang-Siegel GG, Chen C, Mintz KP. Increased sensitivity of Aggregatibacter actinomycetemcomitans to human serum is mediated by induction of a bacteriophage. Mol Oral Microbiol. 2023:38(1):58–70. https://doi.org/10.1111/omi.12378Tang-Siegel GG, Chen C, Mintz KP. Increased sensitivity of Aggregatibacter actinomycetemcomitans to human serum is mediated by induction of a bacteriophage. Mol Oral Microbiol. 2023:38(1):58–70. https://doi.org/10.1111/omi.12378Hbibi A, Bouziane A, Lyoussi B, Zouhdi M, Benazza D. Aggregatibacter actinomycetemcomitans: from basic to advanced research. Adv Exp Med Biol. 2022;1373:45–67. https://doi.org/10.1007/978-3-030-96881-6_3Hbibi A, Bouziane A, Lyoussi B, Zouhdi M, Benazza D. Aggregatibacter actinomycetemcomitans: from basic to advanced research. Adv Exp Med Biol. 2022;1373:45–67. https://doi.org/10.1007/978-3-030-96881-6_3Gholizadeh P, Pormohammad A, Eslami H, Shokouhi B, Fakhrzadeh V, Kafil HS. Oral pathogenesis of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Microb Pathog. 2017;113:303–11. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2017.11.001Gholizadeh P, Pormohammad A, Eslami H, Shokouhi B, Fakhrzadeh V, Kafil HS. Oral pathogenesis of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Microb Pathog. 2017;113:303–11. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2017.11.001Романова НА, Феоктистова НА, Золотухин СН, Васильев ДА, Алешкин АВ. Сравнительная эффективность методов выделения фагов бактерий Bacillus megaterium. Вестник ветеринарии. 2013;(1):26–7. EDN: PLHIWVRomanovа NA, Feoktistovа NA, Zolotukhin SN, Vasilyev DA, Aleshkin AV. Comparative efficacy of isolation methods for phages of Bacillus megaterium. Vestnik Veterinarii. 2013;(1):26–7 (In Russ.). EDN: PLHIWVЛурия С, Дарнелл Дж. Общая вирусология. М.: Мир; 1970.Luria S, Darnell J. General virology. Moscow: Mir; 1970 (In Russ.).Kropinski AM, Prangishvili D, Lavigne R. Position paper: the creation of a rational scheme for the nomenclature of viruses of Bacteria and Archaea. Environ Microbiol. 2009;11(11):2775–7. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2009.01970.xKropinski AM, Prangishvili D, Lavigne R. Position paper: the creation of a rational scheme for the nomenclature of viruses of Bacteria and Archaea. Environ Microbiol. 2009;11(11):2775–7. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2009.01970.xАдамс М. Бактериофаги. М.: Медгиз; 1961.Adams M. Bacteriophages. Moscow: Medgiz; 1961 (In Russ.).Гольдфарб ДМ. Бактериофагия. М.: Медгиз; 1961.Goldfarb DM. Bacteriophagy. Moscow: Medgiz; 1961 (In Russ.).Peng SY, Chen LK, Wu WJ, Paramita P, Yang PW, Li YZ, Lai MJ, Chang KC. Isolation and characterization of a new phage infecting Elizabethkingia anophelis and evaluation of its therapeutic efficacy in vitro and in vivo. Front Microbiol. 2020;11:728. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00728Peng SY, Chen LK, Wu WJ, Paramita P, Yang PW, Li YZ, Lai MJ, Chang KC. Isolation and characterization of a new phage infecting Elizabethkingia anophelis and evaluation of its therapeutic efficacy in vitro and in vivo. Front Microbiol. 2020;11:728. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00728Сульдина ЕВ. Разработка ускоренной схемы идентификации листерий с помощью фагового биопрепарата L.m 4УЛГАУ. Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2020;(4):191–7. https://doi.org/10.18286/1816-4501-2020-4-191-197Suldina EV. Development of quick scheme identification of Listeria using phage biopreparation L.m 4УЛГАУ. Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. 2020;4(52):191–7 (In Russ.). https://doi.org/10.18286/1816-4501-2020-4-191-197Орловская ПИ, Гирилович НИ, Пилипчук ТА, Мандрик-Литвинкович МН, Коломиец ЭИ. Влияние физико-химических факторов на выживаемость бактериофагов фитопатогенных бактерий. В кн.: Коломиец ЭИ, ред. Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. Минск: Беларуская навука; 2021. С. 204–11. https://doi.org/10.47612/2226-3136-2021-13-204-211Orlovskaya PI, Girilovich NI, Pilipchuk TA, Mandrik-Litvinkovich MN, Kolomiets EI. Effect of physico-chemical factors on survival of bacteriophages of phytopathogenic bacteria. In: Kolomiets, ed. Microbial biotechnologies: fundamental and applied aspects. Minsk: Belaruskaya navuka; 2021. P. 204–11 (In Russ.). https://doi.org/10.47612/2226-3136-2021-13-204-211Кочетова ТА, Юскевич ВВ, Садикова ГТ, Попова ВМ. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов, специфичных к Bordetella bronchiseptica. Ветеринария сегодня. 2022;11(3):273–9. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-273-279Kochetova TA, Yuskevich VV, Sadykova GT, Popova VM. Isolation and study of biological properties of Bordetella bronchiseptica-specific bacteriophages. Veterinary Science Today. 2022;11(3):273–9 (In Russ.). https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-273-279Stevens RH, Preus HR, Dokko B, Russell DT, Furgang D, Schreiner HC, et al. Prevalence and distribution of bacteriophage phi Aa DNA in strains of Actinobacillus actinomycetemcomitans. FEMS Microbiol Lett. 1994;119(3):329–37. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1994.tb06909.xStevens RH, Preus HR, Dokko B, Russell DT, Furgang D, Schreiner HC, et al. Prevalence and distribution of bacteriophage phi Aa DNA in strains of Actinobacillus actinomycetemcomitans. FEMS Microbiol Lett. 1994;119(3):329–37. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1994.tb06909.xLoftus A, Delisle AL. Inducible bacteriophages of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Curr Microbiol. 1995;30(5):317–21. https://doi.org/10.1007/BF00295508Loftus A, Delisle AL. Inducible bacteriophages of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Curr Microbiol. 1995;30(5):317–21. https://doi.org/10.1007/BF00295508Dige I, Raarup MK, Nyengaard JR, Kilian M, Nyvad B. Actinomyces naeslundii in initial dental biofilm formation. Microbiology (Reading). 2009;155(Pt 7):2116–26. https://doi.org/10.1099/mic.0.027706-0Dige I, Raarup MK, Nyengaard JR, Kilian M, Nyvad B. Actinomyces naeslundii in initial dental biofilm formation. Microbiology (Reading). 2009;155(Pt 7):2116–26. https://doi.org/10.1099/mic.0.027706-0Arai T, Ochiai K, Senpuku H. Actinomyces naeslundii GroEL-dependent initial attachment and biofilm formation in a flow cell system. J Microbiol Methods. 2015;109:160–6. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2014.12.021Arai T, Ochiai K, Senpuku H. Actinomyces naeslundii GroEL-dependent initial attachment and biofilm formation in a flow cell system. J Microbiol Methods. 2015;109:160–6. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2014.12.021

The authors declare that there are no conflicts of interest present.