biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2024-24-1-91-102biopreparat-534Research ArticleРЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИRECOMBINANT PROTEINSПолучение рекомбинантного флагеллина C Pseudomonas aeruginosa и изучение его иммунобиологических свойствProduction and immunological characterisation of recombinant flagellin C of Pseudomonas aeruginosahttps://orcid.org/0009-0008-1676-9515ЖеребцовА. П.ZherebtsovA. P.

Жеребцов Антон Павлович

Малый Казенный пер., д. 5А, Москва, 105064

Anton P. Zherebtsov

5А Maly Kazenny Ln., Moscow 105064

antonzherebtsov@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8679-2421КалошинА. А.KaloshinA. A.

Калошин Алексей Алексеевич, канд. биол. наук

Малый Казенный пер., д. 5А, Москва, 105064

Alexey A. Kaloshin, Cand. Sci. (Biol.)

5А Maly Kazenny Ln., Moscow 105064

alex-k-1973@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6652-2093МихайловаН. А.MikhailovaN. A.

Михайлова Наталья Александровна, д-р мед. наук, проф.

Малый Казенный пер., д. 5А, Москва, 105064

Natalia A. Mikhailova, Dr. Sci. (Med.), Professor

5А Maly Kazenny Ln., Moscow 105064

n_michailova@inbox.ruФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»РоссияI. Mechnikov Research Institute of Vaccines and SeraRussian Federation202406022024241Стандартизация и контроль качества биологических лекарственных препаратов91102Copyright © Жеребцов А.П., Калошин А.А., Михайлова Н.А., 20242024Жеребцов А.П., Калошин А.А., Михайлова Н.А.Zherebtsov A.P., Kaloshin A.A., Mikhailova N.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/534АКТУАЛЬНОСТЬ

АКТУАЛЬНОСТЬ. Учитывая множественную устойчивость к антимикробным препаратам Pseudomonas aeruginosa – одного из основных возбудителей очаговых и генерализованных форм гнойно-воспалительных заболеваний у людей с ослабленным иммунитетом, актуальной представляется разработка эффективных профилактических вакцин против P. aeruginosa, а также усиление защитных свойств вакцин путем подбора адъювантов. Является перспективным использование флагеллина жгутиков P. aeruginosa как индуктора системы врожденного иммунитета за счет взаимодействия с толл-подобным рецептором 5 типа (TLR5) и активатора Т-клеточного иммунного ответа в качестве компонента или адъюванта при разработке вакцин.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Получение рекомбинантного флагеллина С Р. aeruginosa и изучение его иммуногенных, протективных и адъювантных свойств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Нуклеотидную последовательность гена fliC синтезировали с помощью ПЦР на основе матричной ДНК Р. aeruginosa РА-103 и встраивали в плазмиду pQE-30 для последующей экспрессии в клетках Escherichia coli М15. Очистку рекомбинантного флагеллина С (FliC) Р. aeruginosa проводили в два этапа: выделение телец включения и их последующее растворение в буферных растворах, содержащих мочевину и гуанидин гидрохлорид. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно двукратно с двухнедельным интервалом с использованием очищенного рекомбинантного белка FliC (доза – 50 мкг на животное) и его комбинацией с поверхностным антигеном Klebsiella pneumoniae (соотношение 1:1). Образцы сыворотки крови иммунизированных мышей исследовали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на наличие специфических антител к FliC. Защитные свойства FliC оценивали при экспериментальном внутрибрюшинном заражении мышей культурами Р. aeruginosa РА-103 и K. pneumoniae № 204.

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Получен штамм-продуцент рекомбинантного флагеллина С. Проведена наработка рекомбинантного белка FliC и его очистка (степень чистоты 97,6%). При анализе образцов сыворотки иммунизированных мышей в ИФА и оценке защитных свойств от экспериментально вызываемой инфекции показано, что очищенный рекомбинантный белок FliC обладал иммуногенными свойствами. В группе мышей, иммунизированных FliC, индекс эффективности защитных свойств при инфицировании P. aeruginosa соответствовал 3,0, что свидетельствует о протективном эффекте FliС. Рекомбинантный белок FliC проявлял адъювантные свойства при сочетанном использовании с поверхностным антигеном K. pneumoniae при инфицировании K. pneumonia – индекс эффективности составил 6,1.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Очищенный рекомбинантный флагеллин С Р. aeruginosa обладал протективной активностью при экспериментальной синегнойной инфекции у мышей и проявлял адъювантные свойства при сочетанном введении с поверхностным антигеном K. pneumoniae, увеличивая его иммуногенность. Использование рекомбинантного флагеллина С перспективно для создании кандидатной вакцины против синегнойной инфекции.

SCIENTIFIC RELEVANCE

SCIENTIFIC RELEVANCE. Pseudomonas aeruginosa is one of the main causative agents of focal and diffuse suppurative inflammations in immunocompromised individuals. The multiple antimicrobial resistance of Р. aeruginosa has created an urgent need to develop effective preventive vaccines against this bacterium and to enhance their protective properties by selecting adjuvants. A promising strategy is to use flagellin, a P. aeruginosa flagellum component inducing the innate immune system through interaction with toll-like receptor 5 (TLR5) and activating the T-cell immune response, as a component or adjuvant in vaccine development.

AIM

AIM. This study aimed to produce recombinant flagellin C (FliC) of P. aeruginosa and investigate its immunogenicity, adjuvanticity, and protective properties.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. The fliC nucleotide sequence was obtained by PCR on template DNA of P. aeruginosa PA-103 and was inserted into the pQE-30 plasmid for subsequent expression in Escherichia coli M15. Recombinant FliC purification involved two stages: isolation of inclusion bodies and their dissolution in buffers containing urea and guanidine hydrochloride. Mice were immunised by two intraperitoneal injections with a two-week interval. The immunisation used purified recombinant FliC at a dose of 50 μg per animal and its combination with the Klebsiella pneumoniae surface antigen in a 1:1 ratio. Serum samples from immunised mice were tested for specific antibodies to recombinant FliC by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The protective properties of FliC were assessed by intraperitoneal challenge of mice with cultures of P. aeruginosa PA-103 and K. pneumoniae 204.

RESULTS

RESULTS. The authors obtained the producing strain, generated recombinant FliC, and purified the protein to a 97.6% purity. The analysis of serum samples from immunised mice by ELISA and the protection assessment in challenge experiments showed that the purified recombinant FliC protein had immunogenic properties. Furthermore, the experimental challenge of FliC-immunised mice with P. aeruginosa confirmed that recombinant FliC had protective properties, as evidenced by the protection index of 3.0. Recombinant FliC exhibited adjuvant properties, as demonstrated by the effectiveness index of 6.1 observed in the experimental challenge of mice immunised with the combination of recombinant FliC and the surface antigen of K. pneumoniae.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. The purified recombinant FliC protein of P. aeruginosa demonstrated protective activity in mice challenged with P. aeruginosa and adjuvant properties when combined with the K. pneumoniae surface antigen, increasing the immunogenicity of the latter. The use of recombinant FliC holds promise for the creation of a candidate vaccine against P. aeruginosa infection.

 

 

Pseudomonas aeruginosaKlebsiella pneumoniaeфлагеллин Cрекомбинантный белокFliCадъювантные свойстваиммуногенностьэкспериментальное инфицирование мышейPseudomonas aeruginosaKlebsiella pneumoniaeflagellin Crecombinant proteinFliCadjuvanticityimmunogenicityexperimental infection of miceРабота выполнена без спонсорской поддержкиThe study was performed without external fundingReferencesКолесова ТС. Этиологическая роль синегнойной палочки при различных оппортунистических и внутрибольничных инфекциях. Современная медицина: актуальные вопросы. 2017;(3):134–40. EDN: YHZVONKolesova TS. The causation of blue pus bacillus under different opportunist and hospital-acquired infections. Modern Medicine: Topical Issues. 2017;(3):134–40 (In Russ.). EDN: YHZVONЛазарева АВ, Чеботарь ИВ, Крыжановская ОА, Чеботарь ВИ, Маянский НА. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015;17(3):170–86. EDN: UHPUWPLazareva AV, Chebotar IV, Kryzhanovskaya OA, Chebotar VI, Mayansky NA. Pseudomonas aeruginosa: pathogenicity, pathogenesis and diseases. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2015;17(3):170–86 (In Russ.). EDN: UHPUWPPang Z, Raudonis R, Glick BR, Lin TJ, Cheng Z. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. Biotechnol Adv. 2019;37(1):177–92. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.11.013Pang Z, Raudonis R, Glick BR, Lin TJ, Cheng Z. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. Biotechnol Adv. 2019;37(1):177–92. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.11.013Карпунина ТИ, Кузнецова МВ, Николаева НВ, Демаков ВА. Эпидемиологические аспекты нозокомиальной синегнойной инфекции в многопрофильном хирургическом стационаре. Сибирский медицинский журнал. 2009;24(4–1):70–3. EDN: KZFTAPKarpunina TI, Kuznetsova MV, Nikolaeva NV, Demakov TA. Epidemiological aspects of nosocomial Pseudomonas-based infection in multi-type surgical hospital. Siberian Medical Journal. 2009;24(4–1):70–3 (In Russ.). EDN: KZFTAPParkins MD, Somayaji R, Waters VJ. Epidemiology, biology, and impact of clonal Pseudomonas aeruginosa infections in cystic fibrosis. Clin Microbiol Rev. 2018;31(4):e00019-18. https://doi.org/10.1128/cmr.00019-18Parkins MD, Somayaji R, Waters VJ. Epidemiology, biology, and impact of clonal Pseudomonas aeruginosa infections in cystic fibrosis. Clin Microbiol Rev. 2018;31(4):e00019-18. https://doi.org/10.1128/cmr.00019-18Nedeljković M, Sastre DE, Sundberg EJ. Bacterial flagellar filament: a supramolecular multifunctional nanostructure. Int J Mol Sci. 2021;22(14):7521. https://doi.org/10.3390/ijms22147521Nedeljković M, Sastre DE, Sundberg EJ. Bacterial flagellar filament: a supramolecular multifunctional nanostructure. Int J Mol Sci. 2021;22(14):7521. https://doi.org/10.3390/ijms22147521Hajam IA, Dar PA, Shahnawaz I, Jaume JC, Lee JH. Bacterial flagellin – a potent immunomodulatory agent. Exp Mol Med. 2017;49(9):e373. https://doi.org/10.1038/emm.2017.172Hajam IA, Dar PA, Shahnawaz I, Jaume JC, Lee JH. Bacterial flagellin – a potent immunomodulatory agent. Exp Mol Med. 2017;49(9):e373. https://doi.org/10.1038/emm.2017.172Духовлинов ИВ, Богомолова ЕГ, Федорова ЕА. и др. Исследование протективной активности кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции на основе рекомбинантного белка FliCVP6VP8. Медицинская иммунология. 2016;18(5):417–24. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2016-5-417-424Dukhovlinov IV, Bogomolova EG, Fedorova EA. Protective activity study of a candidate vaccine against rotavirus infection based on recombinant protein FliCVP6VP8. Medical Immunology. 2016;18(5):417–24 (In Russ.). https://doi.org/10.15789/1563-0625-2016-5-417-424Софронов ГА, Мурзина ЕВ, Болехан ВН, Веселова ОМ, Симбирцев АС. Перспективные направления использования препаратов на основе рекомбинантного флагеллина. Медицинский академический журнал. 2017;17(2):7–20. EDN: WUERXUSofronov GA, Murzina EV, Bolekhan VN, Veselova OM, Simbirtsev AS. Perspective direction of using flagellin-based drugs. Medical Academic Journal. 2017;17(2):7–20 (In Russ.). EDN: WUERXUCui B, Liu X, Fang Y, Zhou P, Zhang Y, Wang Y. Flagellin as a vaccine adjuvant. Expert Rev Vaccines. 2018;17(4):335–49. https://doi.org/10.1080/14760584.2018.1457443Cui B, Liu X, Fang Y, Zhou P, Zhang Y, Wang Y. Flagellin as a vaccine adjuvant. Expert Rev Vaccines. 2018;17(4):335–49. https://doi.org/10.1080/14760584.2018.1457443Felgner S, Spöring I, Pawar V, Kocijancic, Preusse M, Falk C, Rohde M, et al. The immunogenic potential of bacterial flagella for Salmonella-mediated tumor therapy. Int J Cancer. 2020;147(2):448–60. https://doi.org/10.1002/ijc.32807Felgner S, Spöring I, Pawar V, Kocijancic, Preusse M, Falk C, Rohde M, et al. The immunogenic potential of bacterial flagella for Salmonella-mediated tumor therapy. Int J Cancer. 2020;147(2):448–60. https://doi.org/10.1002/ijc.32807Егорова НБ, Курбатова ЕА, Ахматова НК, Грубер ИМ. Поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4 и иммуно-терапевтическая концепция ее использования для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых условно патогенными микроорганизмами. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;96(1):43–9. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-43-49Egorova NB, Kurbatova EA, Akhmatova NK, Gruber IM. Polycomponent vaccine Immunovac-VP-4 and immunotherapeutic concept of its use for the prevention and treatment of diseases caused by opportunistic microorganisms. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2019;96(1):43–9 (In Russ.). https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-43-49Калошин АА, Жеребцов АП, Михайлова НА. Рекомбинантная плазмидная ДНК PPA-FLICC, кодирующая синтез рекомбинантного флагеллина-С Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA-FLICC – продуцент гибридного рекомбинантного белка и способ получения указанного белка. Патент Российской Федерации № 2793753; 2023. EDN: RAOQAM.Kaloshin AA, Zherebtsov AP, Mikhailova NA. Recombinant plasmid DNA pPA-FlicC encoding synthesis of recombinant flagellin-C Pseudomonas aeruginosa, strain Escherichia coli PA-FlicC – producer of the hybrid recombinant protein and a method for producing said protein. Patent of the Russian Federation No. № 2793753; 2023 (In Russ.). EDN: RAOQAM.Ашмарин ИП, Воробьев АА. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Медгиз; 1962.Ashmarin IP, Vorobiev AA. Statistical methods in microbiological research. Leningrad: Medgiz; 1962 (In Russ.).Xu SF, Wang P, Liang ZX, Sun JP, Zhao XW, Li AM, Chen LA. Investigation of inflammatory responses of pulmonary microvascular endothelial cells induced by lipopolysaccharide and mechanism. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2011;34(11):816–20 (In Chinese.). PMID: 22333467.Xu SF, Wang P, Liang ZX, Sun JP, Zhao XW, Li AM, Chen LA. Investigation of inflammatory responses of pulmonary microvascular endothelial cells induced by lipopolysaccharide and mechanism. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2011;34(11):816–20 (In Chinese.). PMID: 22333467.Follador R, Heinz E, Wyres KL, Ellington MJ, Kowarik M, Holt KE, Thomson NR. The diversity of Klebsiella pneumonia surface polysaccharides. Microb Genom. 2016;2(8):e000073. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000073Follador R, Heinz E, Wyres KL, Ellington MJ, Kowarik M, Holt KE, Thomson NR. The diversity of Klebsiella pneumonia surface polysaccharides. Microb Genom. 2016;2(8):e000073. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000073

The authors declare that there are no conflicts of interest present.