Константинов Михаил Александрович
ул. Погодинская, д. 10, стр.8, Москва, 119121
Mikhail A. Konstantinov
10/8 Pogodinskaya St., Moscow 119121
Жданов Дмитрий Дмитриевич, д-р биол. наук
ул. Погодинская, д. 10, стр.8, Москва, 119121
Dmitry D. Zhdanov, Dr. Sci. (Biol.)
10/8 Pogodinskaya St., Moscow 119121
Торопыгин Илья Юрьевич, канд. биол. наук
ул. Погодинская, д. 10, стр.8, Москва, 119121
пос. Борок, д. 109, Некоузский район, Ярославская область, 152742
Ilya Yu. Toropygin, Cand. Sci. (Biol.)
10/8 Pogodinskaya St., Moscow 119121
АКТУАЛЬНОСТЬ. При контроле качества протеолитических ферментов, входящих в состав лекарственных препаратов, активность протеаз определяется спектрофотометрически, измерением амидазной или эстеразной активности с синтетическим субстратом, и протеолитической по методу Ансона. Данные методы требуют специальных субстратов, обладают низкой чувствительностью, а их специфичность может оказаться недостаточной и приводить к серьезным ошибкам. Альтернативный подход определения активности протеаз реализуется путем количественного масс-спектрометрического измерения, которое обеспечивается добавлением к продуктам гидролиза испытуемого фермента пептида с изотопной меткой. Такой подход позволяет определять протеолитическую активность, причем по гидролизу конкретных пептидных связей, одновременно с подтверждением подлинности и специфичности испытуемого образца с высокой чувствительностью и без использования специальных субстратов.
ЦЕЛЬ. На примере трипсина и казеина исследовать возможность определения активности фермента методом количественной масс-спектрометрии с меткой ¹⁸О одновременно с подтверждением подлинности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовали трипсин, казеин, H₂¹⁸O (НПО «Изотоп», Россия). Разделение пептидов проводили с помощью системы ВЭЖХ Agilent 1100, масс-спектры получали с использованием масс-спектрометра MALDI-TOF/TOF Bruker Ultraflex II. Количественный масс-спектрометрический анализ проводили, применяя пептид сравнения. Пептид получали путем гидролиза казеина трипсином с последующей очисткой с помощью ВЭЖХ. Для получения пептида с изотопной меткой ¹⁸О исходный пептид высушивали и инкубировали в воде H₂¹⁸О. Количественное определение продукта проводили с применением масс-спектрометрии MALDI-TOF. Для определения активности фермента и расчета константы Михаэлиса (КМ) использовали метод количественной масс-спектрометрии с меткой ¹⁸О.
РЕЗУЛЬТАТЫ. При гидролизе казеина трипсином идентифицированы фрагменты, соответствующие цепям этого белка. Получен изотопно-меченый стандарт, концентрация которого была рассчитана масс-спектрометрически. Определена скорость гидролиза казеина трипсином и рассчитана КМ для трипсина, которая составила 13,65±0,60 мкМ. Стандартное отклонение значений повторных измерений показало, что ошибка измерений оказалась меньше по сравнению со спектрофотометрическим методом, а минимальная установленная чувствительность предложенного метода составила 0,50±0,08 мкМ.
ВЫВОДЫ. Подтверждена возможность применения метода количественного масс-спектрометрического анализа с меткой ¹⁸О для определения активности ферментов на примере трипсина. Установленная чувствительность позволяет оценивать активность фермента одновременно с определением его подлинности и специфичности. Предложенный подход является универсальным, не требует дорогостоящих материалов и реактивов, а также может быть легко адаптирован для определения активности практически любой протеазы.
SCIENTIFIC RELEVANCE. In the quality control of proteolytic enzyme components of medicinal products, the activity of proteases is determined by spectrophotometry, which involves measuring the amidase or esterase activity using a synthetic substrate and the proteolytic activity using the Anson method. These methods require special substrates and have low sensitivity; their specificity may be insufficient, which may lead to serious errors. Quantitative mass spectrometry is an alternative approach to protease activity assays, which involves adding an isotope-labelled peptide to hydrolysates of the test enzyme. This approach allows determining the activity of proteases, notably, by the hydrolysis of specific peptide bonds, while simultaneously confirming the identity and specificity of the test sample. Quantitative mass spectrometry has high sensitivity and does not require special substrates.
AIM. This study aimed to investigate the possibility of enzymatic activity assay and enzyme identification by quantitative mass spectrometry with ¹⁸O labelling through an example of trypsin with casein.
MATERIALS AND METHODS. The study used trypsin, casein, and H₂¹⁸O (Izotop, Russia). Peptide separation was performed using an Agilent 1100 HPLC system; mass spectra were obtained using a Bruker Ultraflex II MALDI-TOF/TOF mass spectrometer. Quantitative mass spectrometry was performed using a standard peptide, which was obtained from casein by tryptic digestion and HPLC purification. For ¹⁸O labelling, the authors dried the peptide and incubated it in H₂¹⁸О water. The quantitative analysis of the product was carried out using MALDI-TOF mass spectrometry. The authors used quantitative mass spectrometry with ¹⁸O labelling to determine enzymatic activity and calculate the Michaelis constant (KM).
RESULTS. Following the tryptic digestion of casein, the authors identified the fragments corresponding to casein chains. The authors produced the isotope-labelled standard peptide and calculated its concentration using mass spectrometry. The authors determined the rate of casein digestion by trypsin and calculated the KM for trypsin, which was 13.65±0.60 μM. The standard deviation for repeated measurements showed that the mass-spectrometric method had a lower error of measurement than the spectrophotometric method. The sensitivity threshold for the mass-spectrometric method was 0.50±0.08 μM.
CONCLUSIONS. The results obtained with trypsin confirm the possibility of enzymatic activity determination by the proposed method of quantitative mass spectrometry with ¹⁸O labelling. According to the sensitivity evaluation results, this method can be used for the simultaneous determination of enzyme activity, identity, and specificity. The proposed mass spectrometry approach is universal, it does not require expensive materials and reagents, and it can be easily adapted to determine the activity of virtually any protease.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.