Воропаев Андрей Андреевич
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, 127051, Москва, Российская Федерация
Andrey A. Voropaev
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation
Фадейкина Ольга Васильевна, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, 127051, Москва, Российская Федерация
Olga V. Fadeikina, Cand. Sci. (Biol.)8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation
Ермолаева Татьяна Николаевна
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, 127051, Москва, Российская Федерация
Tatyana N. Ermolaeva
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation
Давыдов Дмитрий Сергеевич, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, 127051, Москва, Российская Федерация
Dmitry S. Davydov, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation
Актуальность. В работе Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России основной метод работы — лиофилизация, обеспечивающая сохранение свойств депонированных тест-штаммов. Для успешной лиофилизации необходимо экспериментальное определение основных параметров и критических условий процесса.
Цель. Оценить влияние скорости и времени замораживания, времени высушивания, объема заполнения ампул, плотности ватного фильтра на качество коллекционных бактериальных тест-штаммов при лиофилизации на аппарате коллекторного типа.
Материалы и методы. Тест-штаммы Pseudomonas aeruginosa NCTC 12924, Staphylococcus aureus NCTC 10788, Salmonella Abony NCTC 6017 высушивали методом лиофилизации на аппарате коллекторного типа. Замораживание велось при температуре –70±2 °С в низкотемпературном морозильнике (медленная заморозка) и в смеси «сухого льда» со спиртом (быстрая заморозка). Статистическую обработку данных проводили при помощи программ MS Exсel и Statistica, v. 10.
Результаты. Время замораживания ампул в низкотемпературном морозильнике при –70±2 °С не менее 4 ч, дальнейшее хранение возможно при данной температуре до 1 мес. без потери качества конечного продукта. Время замораживания ампул в смеси «сухого льда» и спирта составило менее 1 мин. Различий в показателях качества лиофилизатов, полученных при быстрой и медленной заморозке, не выявлено, кроме внешнего вида: при быстром замораживании таблетка лиофилизата формируется неровная, легко отделяется от стекла и крошится, что нежелательно. Длительность этапа первичного высушивания ампул наполнения 0,2 мл составила 6–8 ч. Показано, что время досушивания в течение 11, 18, 35 и 59 ч приводит к получению лиофилизатов сравнимого качества: количество жизнеспособных микробных клеток (КОЕ/мл) сразу после лиофилизации и по завершении стресс-теста во всех случаях статистически значимо не отличалось. Содержание остаточной влаги при досушивании в течение 59 ч — менее 2 %. Плотность ватного фильтра имеет критическое влияние на качество лиофилизата, рекомендуется использование ватного фильтра массой не более 50 мг.
Выводы. Изучены основные этапы высушивания коллекционных тест-штаммов на аппарате коллекторного типа. Исследовано влияние на качество конечного продукта следующих факторов: скорости и времени замораживания, длительности высушивания, объема заполнения ампул, плотности ватного фильтра. Полученные результаты используются в работе коллекции микроорганизмов.
Scientific relevance. Lyophilisation is the preferred method at the National Collection of Pathogenic Microorganisms (NCPM) of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the Ministry of Health of the Russian Federation. Lyophilisation is used to provide for high standards of test-strain deposition, storage, and transportation and to ensure that test strains maintain their properties. Successful lyophilisation requires conducting experiments to establish the key parameters and critical conditions of the process.
Aim. The study aimed to evaluate the effects that the speed and time of freezing, the time of drying, the fill volume of ampoules, and the density of cotton filters have on the quality of NCPM indicator microorganisms lyophilised in a manifold-type apparatus.
Materials and methods. Pseudomonas aeruginosa NCTC 12924, Staphylococcus aureus NCTC 10788, and Salmonella Abony NCTC 6017 were freeze-dried using a manifold-type apparatus (M. S. R. 18, Usifroid). The authors used a low-temperature freezer at –70±2 °C for slow freezing and a mixture of dry ice and alcohol for quick freezing. The statistical analysis was performed using Microsoft Excel and Statistica 10.
Results. The minimum time needed for freezing the samples in a low-temperature freezer at –70±2 °C was 4 hours. Further storage at this temperature for up to 1 month was shown possible without compromising the quality of the final product. The time needed for freezing the samples in a mixture of dry ice and alcohol was under 1 minute. No differences in quality parameters were observed between the lyophilised samples frozen slowly or quickly, except for the cake appearance. Quick freezing resulted in cakes that were non-uniform, crumbled, and pulled away from the ampoule walls, which is considered undesirable. The primary drying stage for ampoules with a fill volume of 0.2 mL took 6–8 hours. The secondary drying stage of 11, 18, 35, and 59 hours resulted in comparable lyophilisate quality: the authors observed no statistically significant differences in viable cell counts (CFU/mL) at the end of lyophilisation and at the end of stress testing. The residual moisture content after 59-hour secondary drying was less than 2%. The cotton filter density had a critical influence on the lyophilisate quality. Therefore, the authors recommend using cotton filters weighing 50 mg or less.
Conclusions. The authors analysed the main stages of the lyophilisation process used for NCPM test strains and considered the effects that the speed and time of freezing, the time of drying, the fill volume of ampoules, and the density of cotton filters have on the quality of the final lyophilised product. The NCPM has implemented the results of this study in its work.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.