biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2023-23-4-560-569biopreparat-469Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПерспективы применения метода проточной цитометрии в оценке качества препарата вакцины чумной живойProspects for using flow cytometry in the quality control of live plague vaccineshttps://orcid.org/0000-0002-7418-9673АбзаеваН. В.AbzaevaN. V.

Абзаева Наталья Вячеславовна, канд. биол. наук

ул. Советская, д. 13–15, г. Ставрополь, 355035

Natalia V. Abzaeva, Cand. Sci. (Biol.)

13–15 Sovetskaya St., Stavropol 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9513-0761КузнецоваИ. В.KuznetsovaI. V.

Кузнецова Ирина Владимировна, канд. мед. наук

ул. Советская, д. 13–15, г. Ставрополь, 355035

Irina V. Kuznetsova, Cand. Sci. (Med.)

13–15 Sovetskaya St., Stavropol 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9891-3665ГостищеваС. Е.GostischevaS. E.

Гостищева Светлана Евгеньевна, канд. биол. наук

ул. Советская, д. 13–15, г. Ставрополь, 355035

Svetlana E. Gostischeva, Cand. Sci. (Biol.)

13–15 Sovetskaya St., Stavropol 355035

sveta.gostisheva@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7698-7361ЖировА. М.ZhirovA. M.

Жиров Андрей Михайлович

ул. Советская, д. 13–15, г. Ставрополь, 355035

Andrey M. Zhirov

13–15 Sovetskaya St., Stavropol 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9366-5647КовалевД. А.KovalevD. A.

Ковалев Дмитрий Анатольевич, канд. хим. наук

ул. Советская, д. 13–15, г. Ставрополь, 355035

Dmitry A. Kovalev, Cand. Sci. (Chem.)

13–15 Sovetskaya St., Stavropol 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2228-5038КостроминовА. В.KostrominovA. V.

Костроминов Артем Валерьевич

ул. Советская, д. 13–15, г. Ставрополь, 355035

Artem V. Kostrominov

13–15 Sovetskaya St., Stavropol 355035

plagueartem@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3400-9989ФисунА. А.FisunA. A.

Фисун Алиса Анатольевна

ул. Советская, д. 13–15, г. Ставрополь, 355035

Alisa A. Fisun

13–15 Sovetskaya St., Stavropol 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6127-6738ИвановаГ. Ф.IvanovaG. F.

Иванова Галина Филипповна, канд. мед. наук

ул. Советская, д. 13–15, г. Ставрополь, 355035

Galina F. Ivanova, Cand. Sci. (Med.)

13–15 Sovetskaya St., Stavropol 355035

stavnipchi@mail.ruФедеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человекаРоссияStavropol Plague Control Research InstituteRussian Federation202318122023234560569Copyright © Абзаева Н.В., Кузнецова И.В., Гостищева С.Е., Жиров А.М., Ковалев Д.А., Костроминов А.В., Фисун А.А., Иванова Г.Ф., 20232023Абзаева Н.В., Кузнецова И.В., Гостищева С.Е., Жиров А.М., Ковалев Д.А., Костроминов А.В., Фисун А.А., Иванова Г.Ф.Abzaeva N.V., Kuznetsova I.V., Gostischeva S.E., Zhirov A.M., Kovalev D.A., Kostrominov A.V., Fisun A.A., Ivanova G.F.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/469Актуальность

Актуальность. Показатель качества «Количество живых микробных клеток» определяется на всех этапах производства вакцины чумной живой. В настоящее время для определения количества живых микробных клеток используют бактериологический метод. Однако для повышения точности анализа и сокращения времени его проведения перспективным представляется использование метода проточной цитометрии.

Цель

Цель. Изучить возможность применения метода проточной цитометрии в оценке качества препарата вакцины чумной живой.

Материалы и методы

Материалы и методы. Использовали экспериментальные серии вакцины чумной живой (пять серий). Изучение показателя качества «Количество живых микробных клеток» в препарате вакцины проводили бактериологическим методом согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (ФС.3.3.1.0022.15). Цитофлуориметрический анализ образцов проводили с использованием флуоресцентного красителя SynaptoGreen.

Результаты

Результаты. Проведена оценка значения количества живых микробных клеток в образцах вакцин бактериологическим методом, что составило от 27,8±2,2 до 56,5±3,1% (в среднем — 39,8±5,4%), и методом проточной цитометрии — от 29,2±1,2 до 59,1±2,1%, (в среднем — 41,7±5,5%). Статистическая обработка данных показала, что результаты контроля качества препарата вакцины, полученные обоими методами, не имели достоверных различий и характеризовались высоким коэффициентом детерминации.

Выводы

Выводы. Показана целесообразность применения метода проточной цитометрии при контроле качества препарата чумной вакцины при определении количества живых микробных клеток. Высокая информативность, быстрота и простота выполнения анализа делают метод проточной цитометрии более предпочтительным в сравнении с традиционными методами анализа.

Scientific relevance

Scientific relevance. The number of live bacteria is a quality parameter controlled at all stages of live plague vaccine production. Currently, live microbial cell counting uses a bacteriological method. However, flow cytometry has the potential to increase analytical accuracy and reduce testing time.

Aim

Aim. This study aimed at testing the applicability of flow cytometry to assessing the quality of live plague vaccines.

Materials and methods

Materials and methods. The study quantified live microbial cells in 5 experimental batches of live plague vaccine as part of their quality control using the bacteriological method according to the State Pharmacopoeia of the Russian Federation (FS.3.3.1.0022.15). Cytofluorometry of the samples used the SynaptoGreen fluorescent dye.

Results

Results. The study quantified live microbial cells in live plague vaccine samples using the bacteriological method and flow cytometry. The results obtained by the bacteriological method ranged from 27.8±2.2 to 56.5±3.1% with an average of 39.8±5.4%. The results obtained by flow cytometry ranged from 29.2±1.2 to 59.1±2.1% with an average of 41.7±5.5%. The statistical analysis showed no significant difference between the results of vaccine quality control by both methods, as well as a high coefficient of determination.

Conclusions

Conclusions. The results show that flow cytometry is an appropriate method for the quantification of live microbial cells as part of the quality control of plague vaccines. Being quick, easy, and highly informative, flow cytometry is preferable to traditional methods.

метод проточной цитометриивакцина чумная живаяконтроль качестваколичество живых микробных клетокбактериологический методflow cytometrylive plague vaccinequality controlnumber of live bacteriapercentage of live microbial cellsbacteriological methodReferencesКасина ИВ, Ращепкин ЛИ, Горяев АА, Алексеева СА, Немировская ТИ, Мовсесянц АА. Оценка качества вакцины туляремийной живой по результатам испытаний в рамках обязательной сертификации. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016;16(4):253–9. EDN: UWBNNHKasina IV, Raschepkin LI, Goryaev AA, Alekseeva SA, Nemirovskaya TI, Movsesyants AA. Live tularemia vaccine quality assessment according to test results under the mandatory certification. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2016;16(4):253–9 (In Russ.). EDN: UWBNNHFukui M, Takii S. Reduction of tetrazolium salts by sulfate-reducing bacteria. FEMS Microbiol Ecol. 1989;62(1):13–20. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1989.tb03653.xFukui M, Takii S. Reduction of tetrazolium salts by sulfate-reducing bacteria. FEMS Microbiol Ecol. 1989;62(1):13–20. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1989.tb03653.xBhupathiraju VK, Hernandez M, Landfear D, Alvarez-Cohen L. Application of a tetrazolium dye as an indicator of viability in anaerobic bacteria. J Microbiol Methods. 1999;37(3):231–43. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(99)00069-xBhupathiraju VK, Hernandez M, Landfear D, Alvarez-Cohen L. Application of a tetrazolium dye as an indicator of viability in anaerobic bacteria. J Microbiol Methods. 1999;37(3):231–43. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(99)00069-xJohnson MB, Criss AK. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. 2013;(79):e50729. https://doi.org/10.3791/50729Johnson MB, Criss AK. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. 2013;(79):e50729. https://doi.org/10.3791/50729Фихман БА. Иммерсионная микрорефрактометрия бактериальных клеток. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1963;(5).Fikhman BA. Immersion microrefractometry of bacterial cells. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 1963;(5) (In Russ.).Ломакина ГЮ, Модестова ЮА, Угарова НН. Биолюминесцентная детекция жизнеспособности клеток (обзор). Биохимия. 2015;80(6):829–44. EDN: UAAWWFLomakina GYu, Modestova YuA, Ugarova NN. Bioluminescence assay of cell viability. Biochemistry. 2015;80(6):829–44 (In Russ.). EDN: UAAWWFУгарова НН, Ломакина ГЮ, Перевышина ТА, Отрашевская ЕВ, Черников СВ. Контроль жизнеспособности клеток БЦЖ-вакцины в процессе ее производства методом биолюминесцентной АТФ-метрии. Вестник Московского университета. Серия 2: Химия. 2019;60(4):254–62. EDN: TVEZMTUgarova NN, Lomakina GYu, Perevyshina TA, Otrashevskaya EV, Chernikov SV. In-process control of BCG vaccine cell viability by bioluminescent ATP assay. Moscow University Chemistry Bulletin. 2019;60(4):254–62 (In Russ.). EDN: TVEZMTOu F, McGoverin C, Swift S, Vanholsbeeck F. Rapid and cost-effective evaluation of bacterial viability using fluorescence spectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2019;411(16):3653–63. https://doi.org/10.1007/s00216-019-01848-5Ou F, McGoverin C, Swift S, Vanholsbeeck F. Rapid and cost-effective evaluation of bacterial viability using fluorescence spectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2019;411(16):3653–63. https://doi.org/10.1007/s00216-019-01848-5Shimomura Y, Ohno R, Kawai F, Kimbara K. Method for assessment of viability and morphological changes of bacteria in the early stage of colony formation on a simulated natural environment. Appl Environ Microbiol. 2006;72(7):5037–42. https://doi.org/10.1128/AEM.00106-06Shimomura Y, Ohno R, Kawai F, Kimbara K. Method for assessment of viability and morphological changes of bacteria in the early stage of colony formation on a simulated natural environment. Appl Environ Microbiol. 2006;72(7):5037–42. https://doi.org/10.1128/AEM.00106-06Pianetti A, Falcioni T, Bruscolini F, Sabatini L, Sisti E, Papa S. Determination of the viability of Aeromonas hydrophila in different types of water by flow cytometry, and comparison with classical methods. Appl Environ Microbiol. 2005;71(12):7948–54. https://doi.org/10.1128/AEM.71.12.7948-7954.2005Pianetti A, Falcioni T, Bruscolini F, Sabatini L, Sisti E, Papa S. Determination of the viability of Aeromonas hydrophila in different types of water by flow cytometry, and comparison with classical methods. Appl Environ Microbiol. 2005;71(12):7948–54. https://doi.org/10.1128/AEM.71.12.7948-7954.2005Gweon E, Choi C, Kim J, Kim B, Kang H, Park T, et al. Development of a new approach to determine the potency of bacille Calmette–Guérin vaccines using flow cytometry. Osong Public Health Res Perspect. 2017;8(6):389–96. https://doi.org/10.24171/j.phrp.2017.8.6.06Gweon E, Choi C, Kim J, Kim B, Kang H, Park T, et al. Development of a new approach to determine the potency of bacille Calmette–Guérin vaccines using flow cytometry. Osong Public Health Res Perspect. 2017;8(6):389–96. https://doi.org/10.24171/j.phrp.2017.8.6.06Лопатина НВ, Мишанькин БН. Экспериментальная адаптация вакцинного штамма чумного микроба к процессу лиофилизации. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018;17(3):51–6. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-3-51-56Lopatina NV, Mishankin BN. Experimental adaptation of a strain of the plague microbe to lyophilization process. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2018;17(3):51–6 (In Russ.). https://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-3-51-56Massicotte R, Mafu AA, Ahmad D, Deshaies F, Pichette G, Belhumeur P. Comparison between flow cytometry and traditional culture methods for efficacy assessment of six disinfectant agents against nosocomial bacterial species. Front Microbiol. 2017;8:112. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00112Massicotte R, Mafu AA, Ahmad D, Deshaies F, Pichette G, Belhumeur P. Comparison between flow cytometry and traditional culture methods for efficacy assessment of six disinfectant agents against nosocomial bacterial species. Front Microbiol. 2017;8:112. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00112Фисун АА, Абзаева НВ, Ковалев ДА, Кузнецова ИВ, Жиров АМ, Гостищева СЕ и др. Определение количества живых микробных клеток в препарате вакцины чумной живой методом проточной цитометрии. В кн.: Материалы региональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы особо опасных инфекций на Северном Кавказе». Ставрополь; 2022. С. 217–8. EDN: YMVOQIFisun AA, Abzaeva NV, Kovalev DA, Kuznetsova IV, Zhirov AM, Gostishcheva SE, et al. Determination of the number of living microbial cells in the preparation of live plague vaccine by flow cytometry. In: Materials of the regional scientific and practical conference with the international participation “Problems of especially dangerous infections in the North Caucasus”. Stavropol; 2022. P. 217–8 (In Russ.). EDN: YMVOQIShi L, Gunther S, Hubschmann T, Wick LY, Harms H, Muller S. Limits of propidium iodide as a cell viability indicator for environmental bacteria. Cytometry A. 2007;71(8):592–8. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20402Shi L, Gunther S, Hubschmann T, Wick LY, Harms H, Muller S. Limits of propidium iodide as a cell viability indicator for environmental bacteria. Cytometry A. 2007;71(8):592–8. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20402Vanhauteghem D, Demeyere K, Callaert N, Boelaert A, Haesaert G, Audenaert K, et al. Flow cytometry is a powerful tool for assessment of the viability of fungal conidia in metalworking fluids. Appl Environ Microbiol. 2017;83(16):e00938-17. https://doi.org/10.1128/AEM.00938-17Vanhauteghem D, Demeyere K, Callaert N, Boelaert A, Haesaert G, Audenaert K, et al. Flow cytometry is a powerful tool for assessment of the viability of fungal conidia in metalworking fluids. Appl Environ Microbiol. 2017;83(16):e00938-17. https://doi.org/10.1128/AEM.00938-17Zahavy E, Rotem S, Gur D, Aloni-Grinstein R, Aftalion M, Ber R. Rapid antibiotic susceptibility determination for Yersinia pestis using flow cytometry Spectral Intensity Ratio (SIR) fluorescence analysis. J Fluoresc. 2018;28(5):1151–61. https://doi.org/10.1007/s10895-018-2279-3Zahavy E, Rotem S, Gur D, Aloni-Grinstein R, Aftalion M, Ber R. Rapid antibiotic susceptibility determination for Yersinia pestis using flow cytometry Spectral Intensity Ratio (SIR) fluorescence analysis. J Fluoresc. 2018;28(5):1151–61. https://doi.org/10.1007/s10895-018-2279-3Cossarizza A, Chang H-D, Radbruch A, Acs A, Adam D, Adam-Klages S, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019;49(10):1457–973. https://doi.org/10.1002/eji.201970107Cossarizza A, Chang H-D, Radbruch A, Acs A, Adam D, Adam-Klages S, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019;49(10):1457–973. https://doi.org/10.1002/eji.201970107

The authors declare that there are no conflicts of interest present.