biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2023-23-2-203-218biopreparat-461Research ArticleСтатьиРазработка и валидация методики пептидного картирования инновационного препарата ингибитора С1 эстеразыDevelopment and validation of a peptide-mapping procedure for a novel C1 esterase inhibitorhttps://orcid.org/0000-0002-6178-0050ЗубареваЕ. В.ZubarevaE. V.

Зубарева Екатерина Валерьевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Ekaterina V. Zubareva

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

zubareva@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5541-5575ДегтеревМ. Б.DegterevM. D.

Дегтерев Максим Борисович

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Maksim B. Degterev

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

degterev@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6029-4563НероноваМ. Ю.NeronovaM. Yu.

Неронова Мария Юрьевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Maria Yu. Neronova

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

myneronova@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2935-7655СмоловМ. А.SmolovM. A.

Смолов Максим Александрович, канд. хим. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Maksim A. Smolov, Cand. Sci (Chem.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

smolov@ibcgenerium.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6532-7835ШукуровР. Р.ShukurovR. R.

Шукуров Рахим Рахманкулыевич, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125

Rakhim R. Shukurov, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Petushinskiy District, Vladimir Region 601125

shukurov@ibcgenerium.ruАкционерное общество «Генериум»РоссияGenerium JSCRussian Federation202305062023232От традиционных биологических к высокотехнологичным лекарственным препаратам: вопросы разработки и применения203218Copyright © Зубарева Е.В., Дегтерев М.Б., Неронова М.Ю., Смолов М.А., Шукуров Р.Р., 20232023Зубарева Е.В., Дегтерев М.Б., Неронова М.Ю., Смолов М.А., Шукуров Р.Р.Zubareva E.V., Degterev M.D., Neronova M.Y., Smolov M.A., Shukurov R.R.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/461

Пептидное картирование является одним из ключевых методов изучения первичной структуры белка. Метод чувствителен даже к малейшим изменениям в ковалентной структуре белка, что позволяет использовать его для проверки подлинности препарата на стадии контроля и мониторинга стабильности производственного процесса.

Цель работы

Цель работы: разработка и валидация методики пептидного картирования для подтверждения подлинности инновационного высокогликозилированного рекомбинантного белка — ингибитора С1 эстеразы.

Материалы и методы

Материалы и методы: рекомбинантный ингибитор С1 эстеразы человека, трипсин. Исследование проводили методом пептидного картирования с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и метода масс-спектрометрии высокого разрешения. Результаты оценивали с применением статистических методов расчета среднего арифметического, стандартного отклонения, коэффициента вариации. Методику валидировали по показателям: специфичность, прецизионность и устойчивость.

Результаты

Результаты: апробированы разные варианты пробоподготовки трипсинолизатов, включая дополнительную обработку белка N-гликаназой и полное дегликозилирование. Подобраны условия пробоподготовки и хроматографического разделения пептидов ингибитора С1 эстеразы с получением стабильного профиля пептидной карты. Разработаны и определены реперные пики, а также диапазоны их относительных времен удерживания и относительной площади. Абсолютное время удерживания второго (референтного) пика составило 16,5–16,9 мин. Относительное время удерживания пика 9 — 2,14–2,21, пика 12 — 2,55–2,64, пика 14 — 2,97–3,14, пика 15 — 3,11–3,29 и пика 28 — 6,20–6,63.

Выводы

Выводы: разработана методика пептидного картирования ингибитора С1 эстеразы. Оптимизация условий методики позволила сократить время пробоподготовки более чем на 18 ч. Разработанная методика по валидационным характеристикам специфичности, прецизионности и устойчивости соответствовала установленным критериям приемлемости.

Peptide mapping is a key method for studying the primary structure of proteins. With its sensitivity to the slightest changes in the covalent structure of a protein, this method is applicable both to medicinal product identification at the control stage and to production process stability monitoring.

The aim of the study was to develop and validate a peptide-mapping procedure for the identification of a novel highly glycosylated recombinant C1 esterase inhibitor.

Materials and methods

Materials and methods. The authors studied recombinant human C1 esterase inhibitor products and trypsin. The study involved peptide mapping using reverse-phase high-performance liquid chromatography and high-resolution mass spectrometry. The following statistics were calculated to evaluate the results: mean, standard deviation, and coefficient of variation. The validation parameters included specificity, precision, and robustness.

Results

Results. The authors tested several variants of sample preparation for tryptic digests, including additional N-glycanase treatment and complete deglycosylation, and established the optimal conditions for sample preparation and chromatographic separation of C1 esterase inhibitor peptides to obtain consistent chromatographic profiles (peptide maps). The authors identified characteristic peaks and the corresponding relative retention time and area ranges. The absolute retention time of the second (characteristic) peak was approximately 16.5–16.9 minutes. The relative retention times were 2.14–2.21 for peak 9, 2.55–2.64 for peak 12, 2.97–3.14 for peak 14, 3.11–3.29 for peak 15, and 6.20–6.63 for peak 28.

Conclusions

Conclusions. The authors developed a peptide-mapping procedure for C1 esterase inhibitors and optimised the conditions to achieve an over 18-hour reduction in sample preparation time. This procedure met the established acceptance criteria for specificity, precision, and robustness.

ингибитор С1 эстеразырекомбинантный белоквалидация аналитической методикипептидное картированиеОФ ВЭЖХC1 esterase inhibitorrecombinant proteinanalytical method validationpeptide mappingRP-HPLCАО «Генериум» является спонсором разработок инновационного терапевтического белка С1 ингибитора. Работа выполнена на базе лаборатории физико-химических методов Департамента фармацевтического анализа АО «Генериум». Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории, принимавшим участие в работе.Generium JSC sponsored the development of the novel C1 inhibitor therapeutic protein. This study was conducted in the laboratory of physicochemical methods of the Pharmaceutical Analysis Department of Generium JSC. The authors express their gratitude to the colleagues in the laboratory who took part in the study.ReferencesLalonde ME, Durocher Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. J Biotechnol. 2017;251:128–40. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.04.028Lalonde ME, Durocher Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. J Biotechnol. 2017;251:128–40. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.04.028Qian C, Niu B, Jimenez R, Wang J, Albarghouthi M. Fully automated peptide mapping multi-attribute method by liquid chromatography-mass spectrometry with robotic liquid handling system. J Pharm Biomed Anal. 2021;198:113988. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2021.113988Qian C, Niu B, Jimenez R, Wang J, Albarghouthi M. Fully automated peptide mapping multi-attribute method by liquid chromatography-mass spectrometry with robotic liquid handling system. J Pharm Biomed Anal. 2021;198:113988. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2021.113988Bongers J, Cummings JJ, Ebert MB, Federici MM, Gledhill L, Gulati D, et al. Validation of a peptide mapping method for a therapeutic monoclonal antibody: what could we possibly learn about a method we have run 100 times J Pharm Biomed Anal. 2000;21(6):1099–128. https://doi.org/10.1016/s0731-7085(99)00181-8Bongers J, Cummings JJ, Ebert MB, Federici MM, Gledhill L, Gulati D, et al. Validation of a peptide mapping method for a therapeutic monoclonal antibody: what could we possibly learn about a method we have run 100 times J Pharm Biomed Anal. 2000;21(6):1099–128. https://doi.org/10.1016/s0731-7085(99)00181-8Mouchahoir T, Schiel JE. Development of an LC-MS/MS peptide mapping protocol for the NISTmAb. Anal Bioanal Chem. 2018;410(8):2111–26. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0848-6Mouchahoir T, Schiel JE. Development of an LC-MS/MS peptide mapping protocol for the NISTmAb. Anal Bioanal Chem. 2018;410(8):2111–26. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0848-6Allen D, Baffi R, Bausch J, Bongers J, Costello M, Dougherty J Jr, et al. Validation of peptide mapping for protein identity and genetic stability. Biologics and Biotechnology Section, Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Biologicals. 1996;24(3):255–74. https://doi.org/10.1006/biol.1996.0034Allen D, Baffi R, Bausch J, Bongers J, Costello M, Dougherty J Jr, et al. Validation of peptide mapping for protein identity and genetic stability. Biologics and Biotechnology Section, Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Biologicals. 1996;24(3):255–74. https://doi.org/10.1006/biol.1996.0034Andersen N, Vampola L, Jain R, Alvarez M, Chamberlain S, Hilderbrand A, et al. Rapid UHPLC-HRMS peptide mapping for monoclonal antibodies. American Pharmaceutical review. 2014.Andersen N, Vampola L, Jain R, Alvarez M, Chamberlain S, Hilderbrand A, et al. Rapid UHPLC-HRMS peptide mapping for monoclonal antibodies. American Pharmaceutical review. 2014.Xu CF, Wang Y, Bryngelson P, Sosic Z, Zang L. Sequence variant and posttranslational modification analysis during cell line selection via high-throughput peptide mapping. Adv Exp Med Biol. 2019;1140:225–36. https://doi.org/10.1007/978-3-030-15950-4_12Xu CF, Wang Y, Bryngelson P, Sosic Z, Zang L. Sequence variant and posttranslational modification analysis during cell line selection via high-throughput peptide mapping. Adv Exp Med Biol. 2019;1140:225–36. https://doi.org/10.1007/978-3-030-15950-4_12Beinrohr L, Harmat V, Dobó J, Loörincz Z, Gál P, Závodszky P. C1 inhibitor serpin domain structure reveals the likely mechanism of heparin potentiation and conformational disease. J Biol Chem. 2007;282(29):21100–9. https://doi.org/10.1074/jbc.M700841200Beinrohr L, Harmat V, Dobó J, Loörincz Z, Gál P, Závodszky P. C1 inhibitor serpin domain structure reveals the likely mechanism of heparin potentiation and conformational disease. J Biol Chem. 2007;282(29):21100–9. https://doi.org/10.1074/jbc.M700841200Keating GM. Human C1-esterase inhibitor concentrate (Berinert). BioDrugs. 2009;23(6):399–406. https://doi.org/10.2165/11201100-000000000-00000Keating GM. Human C1-esterase inhibitor concentrate (Berinert). BioDrugs. 2009;23(6):399–406. https://doi.org/10.2165/11201100-000000000-00000Ruddy S, Manning MC, Holcomb RE. C1-INH compositions and methods for the prevention and treatment of disorders associated with C1 esterase inhibitor deficiency. Patent of the USA US9616111B2; 2015.Ruddy S, Manning MC, Holcomb RE. C1-INH compositions and methods for the prevention and treatment of disorders associated with C1 esterase inhibitor deficiency. Patent of the USA US9616111B2; 2015.Stavenhagen K, Kayili HM, Holst S, Koeleman CAM, Engel R, Wouters D, et al. N- and O-glycosylation analysis of human C1-inhibitor reveals extensive mucin-type O-glycosylation. Mol Cell Proteomics. 2018;17(6):1225–38. https://doi.org/10.1074/mcp.RA117.000240Stavenhagen K, Kayili HM, Holst S, Koeleman CAM, Engel R, Wouters D, et al. N- and O-glycosylation analysis of human C1-inhibitor reveals extensive mucin-type O-glycosylation. Mol Cell Proteomics. 2018;17(6):1225–38. https://doi.org/10.1074/mcp.RA117.000240Устинникова ОБ, Волкова РА, Мовсесянц АА, Меркулов ВА, Бондарев ВП. Рекомендации по аттестации стандартных образцов для подтверждения подлинности структуры рекомбинантных терапевтических белков. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(2):218–25. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-2-218-225Ustinnikova OB, Volkova RA, Movsesyants AA, Merkulov VA, Bondarev VP. Recommendations on the certification of reference standards for structure identification of recombinant therapeutic proteins. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2022;22(2):218–25 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-2-218-225Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys. 1959;82(1):70–7. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys. 1959;82(1):70–7. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6Riener CK, Kada G, Gruber HJ. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman’s reagent and with 4,4’-dithiodipyridine. Anal Bioanal Chem. 2002;373(4–5):266–76. https://doi.org/10.1007/s00216-002-1347-2Riener CK, Kada G, Gruber HJ. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman’s reagent and with 4,4’-dithiodipyridine. Anal Bioanal Chem. 2002;373(4–5):266–76. https://doi.org/10.1007/s00216-002-1347-2Winther JR, Thorpe C. Quantification of thiols and disulfides. Biochim Biophys Acta. 2014;1840(2):838–46. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.03.031Winther JR, Thorpe C. Quantification of thiols and disulfides. Biochim Biophys Acta. 2014;1840(2):838–46. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.03.031Zubareva E, Degterev M, Kazarov A, Zhiliaeva M, Ulyanova K, Simonov V, et al. Physicochemical and biological characterization of rhC1INH expressed in CHO cells. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(11):1180. https://doi.org/10.3390/ph14111180Zubareva E, Degterev M, Kazarov A, Zhiliaeva M, Ulyanova K, Simonov V, et al. Physicochemical and biological characterization of rhC1INH expressed in CHO cells. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(11):1180. https://doi.org/10.3390/ph14111180Голощапова ЕО, Минеро АС, Рунова ОБ, Устинникова ОБ. Разработка методики пептидного картирования для оценки подлинности рекомбинантного интерферона бета-1b. Биофармацевтический журнал. 2021;13(1):21–6. https://doi.org/10.30906/2073-8099-2021-13-1-21-26Goloshchapova EO, Minero AS, Rounova OB, Ustinnikova OB. Development of a peptide mapping technique to evaluate the authenticity of recombinant interferon beta-1b. Russian Journal of Biopharmaceuticals. 2021;13(1):21–6 (In Russ.). https://doi.org/10.30906/2073-8099-2021-13-1-21-26Устинникова ОБ, Голощапова ЕО, Рунова ОБ, Коротков МГ, Волкова РА. Разработка порядка аттестации стандартного образца метиониновой формы интерферона альфа-2b для подтверждения подлинности методом пептидного картирования. Медицинская иммунология. 2018;20(4):543–50. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-4-543-550Ustinnikova OB, Goloshchapova EO, Runova OB, Korotkov MG, Volkova RA. Development of a qualification procedure for methionine form of interferon alfa-2b standard to confirm its authenticity by means of a peptide mapping method. Medical Immunology (Russia). 2018;20(4):543–50 (In Russ.). https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-4-543-550

The authors declare that there are no conflicts of interest present.