biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2022-450biopreparat-450Research ArticleСтатьиПолучение и характеристика гомодимерной формы RBD S-белка SARS-CoV-2, обладающей повышенной авидностью к специфическим антителамProduction and characterisation of a SARS-CoV-2 S-protein RBD homodimer with increased avidity for specific antibodieshttps://orcid.org/0000-0003-3776-3856ДеркаевА. А.DerkaevA. A.

Деркаев Артем Алексеевич

ул. Гамалеи, д. 18, Москва, 123098

Artem A. Derkaev

18 Gamaleya St., Moscow 123098

derkaev.a@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2687-5185РябоваЕ. И.RyabovaE. I.

Рябова Екатерина Игоревна

ул. Гамалеи, д. 18, Москва, 123098

Ekaterina I. Ryabova

18 Gamaleya St., Moscow 123098

ryabovaei96@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-4130-177XПрокофьевВ. В.ProkofievV. V.

Прокофьев Владимир Владимирович

ул. Гамалеи, д. 18, Москва, 123098

Vladimir V. Prokofiev

18 Gamaleya St., Moscow 123098

vladimir.prokofev2609@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-0639-8390ФаворскаяИ. А.FavorskayaI. A.

Фаворская Ирина Алексеевна, канд. биол. наук

ул. Гамалеи, д. 18, Москва, 123098

Irina A. Favorskaya, Cand. Sci. (Biol.)

18 Gamaleya St., Moscow 123098

irina.favorskaya@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3299-4818ГроусоваД. М.GrousovaD. M.

Гроусова Дарья Михайловна

ул. Гамалеи, д. 18, Москва, 123098

Daria M. Grousova

18 Gamaleya St., Moscow 123098

dgrousova@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-2063-2449ЕсмагамбетовИ. Б.EsmagambetovI. B.

Есмагамбетов Ильяс Булатович, канд. биол. наук

ул. Гамалеи, д. 18, Москва, 123098

Ilias B. Esmagambetov, Cand. Sci. (Biol.)

18 Gamaleya St., Moscow 123098

esmagambetovib@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-2548-6142ДолжиковаИ. В.DolzhikovaI. V.

Должикова Инна Вадимовна, канд. биол. наук

ул. Гамалеи, д. 18, Москва, 123098

Inna V. Dolzhikova, Cand. Sci. (Biol.)

18 Gamaleya St., Moscow 123098

dolzhikova@gamaleya.orghttps://orcid.org/0000-0002-1289-3411ЩебляковД. В.ShcheblyakovD. V.

Щебляков Дмитрий Викторович, канд. биол. наук

ул. Гамалеи, д. 18, Москва, 123098

Dmitry V. Shcheblyakov. Cand. Sci. (Biol.)

18 Gamaleya St., Moscow 123098

sdmitryv@yahoo.comФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияN.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and MicrobiologyRussian Federation202302012023231Вопросы разработки новых противовирусных вакцин7689Copyright © Деркаев А.А., Рябова Е.И., Прокофьев В.В., Фаворская И.А., Гроусова Д.М., Есмагамбетов И.Б., Должикова И.В., Щебляков Д.В., 20232023Деркаев А.А., Рябова Е.И., Прокофьев В.В., Фаворская И.А., Гроусова Д.М., Есмагамбетов И.Б., Должикова И.В., Щебляков Д.В.Derkaev A.A., Ryabova E.I., Prokofiev V.V., Favorskaya I.A., Grousova D.M., Esmagambetov I.B., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/450

Важным параметром, оцениваемым при мониторинге иммунной прослойки у населения и эффективности вакцинации населения, является уровень вируснейтрализующих антител. Разработка подхода к выявлению вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 с помощью безопасного, простого и быстрого метода, не требующего использования живых вирусов, имеет большое значение для борьбы с пандемией COVID-19. Для разработки тест-систем для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), детектирующих потенциально вируснейтрализующие антитела, необходимо получение высокоочищенного рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка, обладающего высокой авидностью к специфическим антителам.

Цель работы

Цель работы: получение и характеристика гомодимерной формы RBD S-белка вируса SARS-CoV-2, а также клеточной линии, продуцирующей рекомбинантный RBD, для создания ИФА тест-системы для выявления потенциально вируснейтрализующих антител.

Материалы и методы

Материалы и методы: дизайн генетической конструкции проводили in silico. Стабильную клеточную линию получали при помощи трансфекции клеток CHO-S, селекции на антибиотике и отбора оптимального клона. Рекомбинантный RBD очищали с использованием хроматографических методов, получали мономерную и гомодимерную формы RBD. Активность полученных форм анализировали с использованием методов Вестерн-блот, биослойной интерферометрии и непрямго ИФА. Для анализа использовали моноклональные антитела GamXRH19, GamP2C5 и h6g3, а также образцы сывороток крови добровольцев, вакцинированных препаратом Гам-КОВИД-Вак, и невакцинированных добровольцев.

Результаты

Результаты: получена клеточная линия CHO-S, стабильно продуцирующая рекомбинантный RBD S-белка вируса SARS-CoV-2. Показано, что при культивировании данной клеточной линии в режиме fed-batch более 7 суток рекомбинантный RBD способен образовывать гомодимеры за счет наличия неспаренных цистеинов. Количественный выход очищенного рекомбинантного RBD из культуральной жидкости составил 30–50 мг/л. Мономерная и гомодимерная формы RBD были разделены при помощи гель-фильтрации и охарактеризованы по способности взаимодействовать со специфическими моноклональными антителами, а также сыворотками крови от вакцинированных добровольцев. Продемонстрировано, что именно гомодимерная форма рекомбинантного RBD обладает повышенной авидностью к моноклональным антителам и антителам в сыворотке крови вакцинированных.

Выводы

Выводы: гомодимерная форма рекомбинантного RBD может являться более предпочтительной для анализа уровня антител к рецептор-связывающему домену S-белка вируса SARS-CoV-2.

Monitoring of the proportion of immune individuals and the effectiveness of vaccination in a population involves evaluation of several important parameters, including the level of virus-neutralising antibodies. In order to combat the COVID-19 pandemic, it is essential to develop approaches to detecting SARS-CoV-2 neutralising antibodies by safe, simple and rapid methods that do not require live viruses. To develop a test system for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that detects potential neutralising antibodies, it is necessary to obtain a highly purified recombinant receptor-binding domain (RBD) of the spike (S) protein with high avidity for specific antibodies.

The aim of the study was to obtain and characterise a SARS-CoV-2 S-protein RBD homodimer and a recombinant RBD-expressing cell line, as well as to create an ELISA system for detecting potential neutralising antibodies.

Materials and methods

Materials and methods: the genetic construct was designed in silico. To generate a stable producer cell line, the authors transfected CHO-S cells, subjected them to antibiotic pressure, and selected the optimal clone. To isolate monomeric and homodimeric RBD forms, the authors purified the recombinant RBD by chromatographic methods. Further, they analysed the activity of the RBD forms by Western blotting, bio-layer interferometry, and indirect ELISA. The analysis involved mono clonal antibodies GamXRH19, GamP2C5, and h6g3, as well as serum samples from volunteers vaccinated with Gam-COVID-Vac (Sputnik V) and unvaccinated ones.

Results

Results: the authors produced the CHO-S cell line for stable expression of the recombinant SARS-CoV-2 S-protein RBD. The study demonstrated the recombinant RBD’s ability to homodimerise after fed-batch cultivation of the cell line for more than 7 days due to the presence of unpaired cysteines. The purified recombinant RBD yield from culture broth was 30–50 mg/L. Monomeric and homodimeric RBD forms were separated using gel-filtration chromatography and characterised by their ability to interact with specific monoclonal antibodies, as well as with serum samples from vaccinated volunteers. The homodimeric recombinant RBD showed increased avidity for both monoclonal and immune sera antibodies.

Conclusions

Conclusions: the homodimeric recombinant RBD may be more preferable for the analysis of levels of antibodies to the receptor-binding domain of the SARS-CoV-2 S protein.

рекомбинантный белоккоронавирусная инфекциярецептор-связывающий доменSARS-CoV-2авидностьrecombinant proteincoronavirus infectionreceptor-binding domainSARS-CoV-2avidityРабота выполнена в рамках гранта № 01-04-413 от 28.04.2020. Департамента здравоохранения города Москвы «Создание тест-системы для оценки активности плазмы крови «SARS-CoV-2-RBD-ИФА-Гамалеи».The study was supported by grant No. 01-04-413 “Development of the SARS-CoV-2-RBD-ELISA-Gamaleya test system for plasma activity assessment” of 28.04.2020 by the Moscow Department of Health.ReferencesYang Y, Du L. SARS-CoV-2 spike protein: a key target for eliciting persistent neutralizing antibodies. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):95. https://doi.org/10.1038/s41392-021-00523-5Yang Y, Du L. SARS-CoV-2 spike protein: a key target for eliciting persistent neutralizing antibodies. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):95. https://doi.org/10.1038/s41392-021-00523-5Piccoli L, Park Y-J, Tortorici MA, Czudnochowski N, Walls AC, Beltramello M, et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 2020;183(4):1024–42.e21. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.037Piccoli L, Park Y-J, Tortorici MA, Czudnochowski N, Walls AC, Beltramello M, et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 2020;183(4):1024–42.e21. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.037Рябова ЕИ, Деркаев АА, Есмагамбетов ИБ, Щебляков ДВ, Довгий МА, Бырихина ДВ и др. Сравнение различных технологий получения рекомбинантного аденоассоциированного вируса в лабораторном масштабе. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2021;21(4):266–78. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2021-21-4-266-278Ryabova EI, Derkaev AA, Esmagambetov IB, Shcheblyakov DV, Dovgiy MA, Byrikhina DV, et al. Comparison of different technologies for producing recombinant adeno-associated virus on a laboratory scale. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2021;21(4):266–78 (In Russ). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2021-21-4-266-278Favorskaya IA, Shcheblyakov DV, Esmagambetov IB, Dolzhikova IV, Alekseeva IA, Korobkova AI, et al. Single-domain antibodies efficiently neutralize SARS-CoV-2 variants of concern. Front Immunol. 2022;13:822159. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.822159Favorskaya IA, Shcheblyakov DV, Esmagambetov IB, Dolzhikova IV, Alekseeva IA, Korobkova AI, et al. Single-domain antibodies efficiently neutralize SARS-CoV-2 variants of concern. Front Immunol. 2022;13:822159. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.822159Есмагамбетов ИБ, Щебляков ДВ, Егорова ДА, Воронина ОЛ, Деркаев АА, Воронина ДВ и др. Наноантитела — потенциальный терапевтический препарат против лихорадки Эбола. Acta Naturae. 2021;13(4):53–63. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11487Esmagambetov IB, Shcheblyakov DV, Egorova DA, Voronina OL, Derkaev AA, Voronina DV, et al. Nano-bodies are potential therapeutic agents for the Ebola virus infection. Acta Naturae. 2021;13(4):53–63. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11487Воронина ДВ, Щебляков ДВ, Есмагамбетов ИБ, Деркаев АА, Попова О, Щербинин ДН. Получение нейтрализующих наноантител к стеблевому домену гемагглютинина вируса гриппа типа А. Acta Naturae. 2021;13(4):33–41. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11495Voronina DV, Shcheblyakov DV, Esmagambetov IB, Derkaev AA, Popova O, Shcherbinin DN. Development of neutralizing nanobodies to the hemagglutinin stem domain of influenza A viruses. Acta Naturae. 2021;13(4):33–41. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11495Pang NY-L, Pang AS-R, Chow VT, Wang D-Y. Understanding neutralising antibodies against SARS-CoV-2 and their implications in clinical practice. Mil Med Res. 2021;8(1):47. https://doi.org/10.1186/s40779-021-00342-3Pang NY-L, Pang AS-R, Chow VT, Wang D-Y. Understanding neutralising antibodies against SARS-CoV-2 and their implications in clinical practice. Mil Med Res. 2021;8(1):47. https://doi.org/10.1186/s40779-021-00342-3Shcheblyakov D, Esmagambetov I, Simakin P, Kostina L, Kozlov A, Tsibezov V, et al. Development and characterization of two GP-specific monoclonal antibodies, which synergistically protect non-human primates against Ebola lethal infection. Antiviral Res. 2019;172:104617. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2019.104617Shcheblyakov D, Esmagambetov I, Simakin P, Kostina L, Kozlov A, Tsibezov V, et al. Development and characterization of two GP-specific monoclonal antibodies, which synergistically protect non-human primates against Ebola lethal infection. Antiviral Res. 2019;172:104617. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2019.104617Dogan M, Kozhaya L, Placek L, Gunter C, Yigit M, Hardy R, et al. SARS-CoV-2 specific antibody and neutralization assays reveal the wide range of the humoral immune response to virus. Commun Biol. 2021;4(1):129. https://doi.org/10.1038/s42003-021-01649-6Dogan M, Kozhaya L, Placek L, Gunter C, Yigit M, Hardy R, et al. SARS-CoV-2 specific antibody and neutralization assays reveal the wide range of the humoral immune response to virus. Commun Biol. 2021;4(1):129. https://doi.org/10.1038/s42003-021-01649-6Takheaw N, Liwsrisakun C, Chaiwong W, Laopajon W, Pata S, Inchai J, et al. Correlation analysis of anti-SARS-CoV-2 RBD IgG and neutralizing antibody against SARS-CoV-2 Omicron variants after vaccination. Diagnostics. 2022;12(6):1315. https://doi.org/10.3390/diagnostics12061315Takheaw N, Liwsrisakun C, Chaiwong W, Laopajon W, Pata S, Inchai J, et al. Correlation analysis of anti-SARS-CoV-2 RBD IgG and neutralizing antibody against SARS-CoV-2 Omicron variants after vaccination. Diagnostics. 2022;12(6):1315. https://doi.org/10.3390/diagnostics12061315Luo S, Xu J, Cho CY, Zhu S, Whittaker KC, Wang X, et al. Quantitative detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies using indirect ELISA. Lab Med. 2022;53(3):225–34. https://doi.org/10.1093/labmed/lmab085Luo S, Xu J, Cho CY, Zhu S, Whittaker KC, Wang X, et al. Quantitative detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies using indirect ELISA. Lab Med. 2022;53(3):225–34. https://doi.org/10.1093/labmed/lmab085Mehdi F, Chattopadhyay S, Thiruvengadam R, Yadav S, Kumar M, Sinha SK, et al. Development of a fast SARS-CoV-2 IgG ELISA, based on receptor-binding domain, and its comparative evaluation using temporally segregated samples from RT-PCR positive individuals. Front Microbiol. 2021;11:618097. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.618097Mehdi F, Chattopadhyay S, Thiruvengadam R, Yadav S, Kumar M, Sinha SK, et al. Development of a fast SARS-CoV-2 IgG ELISA, based on receptor-binding domain, and its comparative evaluation using temporally segregated samples from RT-PCR positive individuals. Front Microbiol. 2021;11:618097. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.618097Shajahan A, Supekar NT, Gleinich AS, Azadi P. Deducing the N- and O-glycosylation profile of the spike protein of novel coronavirus SARS-CoV-2. Glycobiology. 2020;30(12):981–8. https://doi.org/10.1093/glycob/cwaa042Shajahan A, Supekar NT, Gleinich AS, Azadi P. Deducing the N- and O-glycosylation profile of the spike protein of novel coronavirus SARS-CoV-2. Glycobiology. 2020;30(12):981–8. https://doi.org/10.1093/glycob/cwaa042Walls AC, Park Y-J, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 2020;181(2):281–92.e6. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058Walls AC, Park Y-J, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 2020;181(2):281–92.e6. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058Watanabe Y, Allen JD, Wrapp D, McLellan JS, Crispin M. Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike. Science. 2020;369(6501):330–3. https://doi.org/10.1126/science.abb9983Watanabe Y, Allen JD, Wrapp D, McLellan JS, Crispin M. Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike. Science. 2020;369(6501):330–3. https://doi.org/10.1126/science.abb9983Kim JY, Kim Y-G, Lee GM. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;93(3):917–30. https://doi.org/10.1007/s00253-011-3758-5Kim JY, Kim Y-G, Lee GM. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;93(3):917–30. https://doi.org/10.1007/s00253-011-3758-5

The authors declare that there are no conflicts of interest present.