biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2020-20-4-268-276biopreparat-319Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESИсследование гемостимулирующих свойств рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человекаStudy on Hemostimulating Properties of Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factorhttps://orcid.org/0000-0002-1078-7033ШиминаГ. Г.ShiminaG. G.

Шимина Галина Григорьевна,

ул. Химзаводская, д. 9, Бердск, Новосибирская область, 633010

Galina G. Shimina,

9 Khimzavodskaya St., Berdsk, Novosibirsk oblast 633010

shimina_gg@vector.nsc.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3761-7798БатеневаА. В.BatenevaA. V.

Батенева Алена Владимировна,

ул. Химзаводская, д. 9, Бердск, Новосибирская область, 633010

Alena V. Bateneva,

9 Khimzavodskaya St., Berdsk, Novosibirsk oblast 633010

bateneva_av@vector.nsc.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7441-333XГамалейС. Г.GamaleyS. G.

Гамалей Светлана Георгиевна,

ул. Химзаводская, д. 9, Бердск, Новосибирская область, 633010

Svetlana G. Gamaley,

9 Khimzavodskaya St., Berdsk, Novosibirsk oblast 633010

gamaley_sg@vector.nsc.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9006-8313ЕсинаТ. И.EsinaT. I.

Есина Татьяна Игоревна,

ул. Химзаводская, д. 9, Бердск, Новосибирская область, 633010

Tatyana I. Esina,

9 Khimzavodskaya St., Berdsk, Novosibirsk oblast 633010

esina_ti@vector.nsc.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4586-0875ТерещенкоТ. Г.TereshchenkoT. G.

Терещенко Татьяна Геннадьевна,

ул. Химзаводская, д. 9, Бердск, Новосибирская область, 633010

Tatyana G. Tereshchenko,

9 Khimzavodskaya St., Berdsk, Novosibirsk oblast 633010

tereschenko_tg@vector.nsc.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5026-1602ДаниленкоЕ. Д.DanilenkoE. D.

Даниленко Елена Дмитриевна, канд. биол. наук,

ул. Химзаводская, д. 9, Бердск, Новосибирская область, 633010

Elena D. Danilenko, Cand. Sci. (Biol.),

9 Khimzavodskaya St., Berdsk, Novosibirsk oblast 633010

danilenko_ed@vector.nsc.ruИнститут медицинской биотехнологии Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человекаРоссияState Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human WellbeingRussian Federation202024112020204268276Copyright © Шимина Г.Г., Батенева А.В., Гамалей С.Г., Есина Т.И., Терещенко Т.Г., Даниленко Е.Д., 20202020Шимина Г.Г., Батенева А.В., Гамалей С.Г., Есина Т.И., Терещенко Т.Г., Даниленко Е.Д.Shimina G.G., Bateneva A.V., Gamaley S.G., Esina T.I., Tereshchenko T.G., Danilenko E.D.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/319

Гемостимулирующие свойства гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) позволяют использовать его в клинике для снижения побочных эффектов радио- и химиотерапии онкологических заболеваний, при трансплантации костного мозга, для лечения некоторых первичных иммунодефицитных состояний, связанных с лейкопенией. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора разработана высокопроизводительная технология получения рекомбинантного ГМ-КСФ человека (рчГМ-КСФ) на основе рекомбинантного штамма E. coli. Цель работы: изучение гемостимулирующей активности препарата рекомбинантного ГМ-КСФ человека, полученного по разработанной технологии, в культуре клеток и на модели миелосупрессии у мышей, вызванной введением циклофосфана. Материалы и методы: оценку гемостимулирующей активности рчГМ-КСФ in vitro проводили с использованием МТТ-теста на коммерческой культуре клеток промиелоцитарной лейкемии HL-60, скорость роста которых предварительно подавляли добавлением в среду низкой концентрации диметилсульфоксида. Исследования in vivo проводили на мышах линии СВА/Calaс в условиях миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана. Гемостимулирующие свойства препарата оценивали при его подкожном введении в диапазоне доз от 1 до 175 мкг/кг в течение 4–5 суток после введения цитостатика. В образцах крови, взятых в разные сроки после введения, определяли общее количество лейкоцитов и содержание их морфологических форм. Данные эксперимента обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета программ Statgraphics, v. 5.0. Результаты: пролиферативная активность клеток HL-60, инкубированных с препаратом рчГМ-КСФ в течение 72 ч, носила дозозависимый характер. Наиболее высокие значения повышения пролиферативной активности при увеличении дозы препарата наблюдались в диапазоне концентраций от 0,04 до 0,64 нг/мл (прирост значений показателя при двукратном увеличении дозы составлял 11–18%). В экспериментах на мышах продемонстрирован двухфазный характер дозовой зависимости эффекта. Наибольшую гемостимулирующую активность препарат проявлял в дозе 90 мкг/кг. Выводы: препарат рчГМ-КСФ, полученный по разработанной технологии, обладает выраженной гемостимулирующей активностью, подтвержденной в системах in vitro и in vivo.

The hemostimulating properties of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) make possible its clinical use in alleviating side effects of anti-cancer radio- and chemotherapy, in bone marrow transplantation, and in the treatment of some primary immunodeficiency conditions associated with leukopenia. The State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing has developed a high-performance technology for production of recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF) based on a recombinant E. coli strain. The aim of the study was to assess hemostimulating activity of the rhGM-CSF preparation obtained using the new developed technology, as observed in cell culture and in the mice model of myelosuppression induced by cyclophosphamide administration. Materials and methods: in vitro evaluation of rhGM-CSF hemostimulating activity was performed by MTT assay in the commercial HL-60 promyelocytic leukemia cell culture with preliminary suppression of cell growth rate by adding a low concentration of dimethyl sulfoxide to the medium. In vivo studies were carried out in CBA/CaLac mice with cyclophosphamide-induced myelosuppression. The hemostimulating properties of the drug were evaluated after subcutaneous administration of 1–175 µg/kg doses for 4–5 days, following administration of a cytostatic agent. The total number of leukocytes and the content of their morphological forms were determined in blood samples taken at different time points after the drug administration. The statistical processing of the experimental data was based on analysis of variance using Statgraphics v. 5.0 software. Results: the proliferative activity of HL-60 cells incubated with the rhGM-CSF preparation for 72 hours was shown to be dose-dependent. The highest values of the increase in proliferative activity associated with an increase in the drug dose were observed in the concentration range from 0.04 to 0.64 ng/mL (proliferative activity increased by 11–18% when the dose was increased twofold). The experiments in mice demonstrated a two-phase pattern of the dose-dependent effect. The drug showed the highest hemostimulating effect at the dose of 90 µg/kg. Conclusions: the rhGM-CSF preparation obtained using the new developed technology has a pronounced hemostimulating activity confirmed by both in vitro and in vivo test systems. 

рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека (рчГМ-КСФ)гемостимулирующая активностьмиелосупрессияциклофосфанмыши линии СВА/Calaскультура клеток HL-60recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF)hemostimulating activitymyelosuppressioncyclophosphamideСВА/CaLaс miceHL-60 cell cultureРабота выполнена в рамках государственного задания ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора № 13/18 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР АААА-А18-118062290093-9).ReferencesБагрова СГ. Гранулоцитарные колониестимулирующие факторы в профилактике фебрильной нейтропении. Эффективная фармакотерапия. 2015;(31):6–15.Bagrova SG. Granulocyte colony-stimulating factors in prevention of febrile neutropenia. Effektivnaya farmakoterapiya = Effective Pharmacotherapy. 2015;(31):6–15 (In Russ.)Мальцев ДВ. Показания к применению колониестимулирующих факторов в клинической практике. Клиническая иммунология, аллергология и инфектология. 2018;(1):5–12.Maltsev DV. Indications for the use of colony-stimulating factors in clinical practice. Klinicheskaya immunologiya. Allergologiya. Infektologiya = Clinical Immunology. Allergology. Infectology. 2018;(1):5–12 (In Russ.)Половинкина ВС, Косоруков ВС. Рекомбинантный чГМКСФ в онкологии. Российский биотерапевтический журнал. 2009;8(1):29–39.Polovinkina VS, Kosorukov VS. Recombinant hGM-CSF in antitumor therapy. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy. 2009;8(1):29–39 (In Russ.)Газатова НД, Меняйло МЕ, Малащенко ВВ, Гончаров АГ, Мелащенко ОБ, Морозова ЕМ, Селедцов ВИ. Прямые эффекты гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора на функциональные свойства моноцитов/макрофагов человека. Медицинская иммунология. 2019;21(3):419–26. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2019-3-419-426Gazatova ND, Meniailo ME, Malashchenko VV, Goncharov AG, Melashchenko OB, Morozova EM, Seledtsov VI. Direct effects of GM-CSF on the functions of human monocytes/macrophages. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia). 2019;21(3):419–26 (In Russ.) https://doi.org/10.15789/1563-0625-2019-3-419-426Warren TL, Weiner GJ. Uses of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in vaccine development. Curr Opin Hematol. 2000;7(3):168–73. https://doi.org/10.1097/00062752-200005000-00007Warren TL, Weiner GJ. Uses of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in vaccine development. Curr Opin Hematol. 2000;7(3):168–73. https://doi.org/10.1097/00062752-200005000-00007Белогурова МБ. Клиническое использование гемопоэтических ростовых факторов. Практическая онкология. 2003;4(3):183–90.Belogurova MB. Clinical use of hematopoietic growth factors. Prakticheskaya onkologiya = Practical Oncology. 2003;4(3):183–90 (In Russ.)Francisco-Cruz A, Aguilar-Santelises M, Ramos-Espinosa O, Mata-Espinosa D, Marquina-Castillo B, Barrios-Payan J, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: not just another haematopoietic growth factor. Med Oncol. 2014;31(1):774. https://doi.org/10.1007/s12032-013-0774-6Francisco-Cruz A, Aguilar-Santelises M, Ramos-Espinosa O, Mata-Espinosa D, Marquina-Castillo B, Barrios-Payan J, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: not just another haematopoietic growth factor. Med Oncol. 2014;31(1):774. https://doi.org/10.1007/s12032-013-0774-6Libby RT, Braedt G, Kronheim SR, March CJ, Urdal DL, Chiaverotti SR, et al. Expression and purification of native human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from an Escherichia coli secretion vector. DNA. 1987;6(3):221–9. https://doi.org/10.1089/dna.1987.6.221Libby RT, Braedt G, Kronheim SR, March CJ, Urdal DL, Chiaverotti SR, et al. Expression and purification of native human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from an Escherichia coli secretion vector. DNA. 1987;6(3):221–9. https://doi.org/10.1089/dna.1987.6.221Delamarter J, Ernst JF. Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and process for producing them in high yields in microbial cells. WO1987002060. 1987.Delamarter J, Ernst JF. Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and process for producing them in high yields in microbial cells. WO1987002060. 1987.Есина ТИ, Лебедев ЛР, Волосникова ЕА, Гилева ИП, Гогина ЯС, Терещенко ТА и др. Способ получения рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. Биотехнология. 2019;35(3):68–73. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2019-35-3-68-73Esina TI, Lebedev LR, Volosnikova EA, Gileva IP, Gogina YaS, Tereshchenko TA, et al. Method for obtaining recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Biotekhnologiya = Biotechnology. 2019;35(3):68–73 (In Russ.) https://doi.org/10.21519/0234-2758-2019-35-3-68-73Гилева ИП, Есина ТИ, Волосникова ЕА, Гогина ЯС, Лебедев ЛР, Даниленко ЕД. Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E. COLI SG 20050/ p280_2GM — продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида. Патент Российской Федерации № 2708556; 2019.Gileva IP, Esina TI, Volosnikova EA, Gogina YaS, Lebedev LR, Danilenko ED. Recombinant plasmid DNA p280_2GM coding polypeptide with properties of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor of human, strain Escherichia coli SG 20050/p280_2GM — producer of polypeptide with properties of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor of human and method of obtaining of said polypeptide. Patent of the Russian Federation № 2708556; 2019 (In Russ.)Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248–54. https://doi.org/10.1006/abio.1976.9999Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248–54. https://doi.org/10.1006/abio.1976.9999Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680–5. https://doi.org/10.1038/227680a0Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680–5. https://doi.org/10.1038/227680a0Yamaguchi T, Yamaguchi T, Kogi M, Yamamoto Y, Hayakawa T. Bioassay of human granulocyte colony-stimulating factor using human promyelocytic HL-60 cells. Biol Pharm Bull. 1997;20(9):943–7. https://doi.org/10.1248/bpb.20.943Yamaguchi T, Yamaguchi T, Kogi M, Yamamoto Y, Hayakawa T. Bioassay of human granulocyte colony-stimulating factor using human promyelocytic HL-60 cells. Biol Pharm Bull. 1997;20(9):943–7. https://doi.org/10.1248/bpb.20.943Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65(1–2):55–63. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65(1–2):55–63. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4Масычева ВИ, Даниленко ЕД, Шимина ГГ, Гвоздева ТС, Алямкина ЕА, Долгова ЕВ и др. Изучение гемостимулирующей активности нуклеопротеидного комплекса, выделенного из плаценты человека. Сибирский онкологический журнал. 2012;(5):34–8.Masycheva BI, Danilenko ED, Shimina GG, Gvozdeva TS, Alyamkina EA, Dolgova EV, et al. Study of hemostimulating activity of nucleoprotein complex extracted from the human placenta. Sibirskiy onkologicheskiy zhurnal = Siberian Journal of Oncology. 2012;(5):34–8 (In Russ.)Новицкий ВВ, Евтушенко ОМ. Руководство к практическим занятиям по гематологии. Томск: Сибирский медицинский университет; 1999.Novitskiy VV, Evtushenko OM. A guide to practical studies on hematology. Tomsk: Siberian Medical University; 1999 (In Russ.)Гржибовский АМ. Анализ трех и более независимых групп количественных данных. Экология человека. 2008;(3):50–8.Grjibovsky AM. Analysis of three and more independent groups quantitative data. Ekologiya cheloveka = Human Ecology. 2008;(3):50–8 (In Russ.)Гражданцева АА, Сиволобова ГФ, Ткачева АВ, Гилева ИП, Кулигина ЕВ, Рихтер ВА, Кочнева ГВ. Высокоэффективная продукция биологически активного секретируемого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека рекомбинантным вирусом осповакцины. Биотехнология. 2015;31(5):13–21.Grazhdantseva AA, Sivolobova GF, Tkacheva AV, Gileva IP, Kuligina EV, Rikhter VA, Kochneva GV, et al. Highly effective production of biologically active, secreted, human granulocyte macrophage colony-stimulating factor by recombinant vaccinia virus. Biotekhnologiya = Biotechnology. 2015;31(5):13–21 (In Russ.)Веселовский ВА, Веселова ТВ, Чернавский ДС. Трехфазная (парадоксальная) дозовая зависимость реакции растительной клетки на факторы внешней среды. Российский химический журнал. 1999;43(5):49–54.Veselovsky VA, Veselova TV, Chernavsky DS. Three-phase (paradoxical) dose-dependent response of a plant cell to environmental factors. Rossiyskiy khimicheskiy zhurnal = Russian Journal of General Chemistry. 1999;43(5):49–54 (In Russ.)Parmiani G, Castelli C, Pilla L, Santinami M, Colombo MP, Rivoltini L. Opposite immune functions of GM-CSF administered as vaccine adjuvant in cancer patients. Ann Oncol. 2007;18(2):226–32. https://doi.org/10.1093/annonc/mdl158Parmiani G, Castelli C, Pilla L, Santinami M, Colombo MP, Rivoltini L. Opposite immune functions of GM-CSF administered as vaccine adjuvant in cancer patients. Ann Oncol. 2007;18(2):226–32. https://doi.org/10.1093/annonc/mdl158Sun L, Rautela J, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Carrington EM, Schenk RL, et al. GM-CSF quantity has a selective effect on granulocytic vs. monocytic myeloid development and function. Front Immunol. 2018;9:1922.Sun L, Rautela J, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Carrington EM, Schenk RL, et al. GM-CSF quantity has a selective effect on granulocytic vs. monocytic myeloid development and function. Front Immunol. 2018;9:1922.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.