biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2020-20-3-193-201biopreparat-290Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESСравнительный анализ красителей, используемых при оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима биологическим методом in vitroComparative Analysis of Dyes Used in the Assessment of Filgrastim Products Specific Activity by Biological in vitro Methodshttps://orcid.org/0000-0002-6966-9859ГоловинскаяО. В.GolovinskayaO. V.

Головинская Ольга Вячеславовна, канд. мед. наук.

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Olga V. Golovinskaya, Cand. Sci. (Med.).

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

golovinskaya@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9889-4038БайковаМ. Л.BaykovaM. L.

Байкова Марина Леонидовна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Marina L. Baykova

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

golovinskaya@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6807-508XАлпатоваН. А.AlpatovaN. A.

Алпатова Наталья Александровна, канд. биол. наук.

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Natalia A. Alpatova, Cand. Sci. (Biol.).

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

alpatova@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6970-1732ЗубковД. А.ZubkovD. A.

Зубков Дмитрий Анатольевич

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Dmitry A. Zubkov

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

zubkov@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8677-0927ФоменкоВ. В.FomenkoV. V.

Фоменко Виктория Валерьевна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Viktoria V. Fomenko

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

fomenkovv@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6176-5934ГайдероваЛ. А.GayderovaL. A.

Гайдерова Лидия Александровна, канд. мед. наук.

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Lidia A. Gayderova, Cand. Sci. (Med.).

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051

gaiderova@expmed.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияScientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsRussian Federation202029072020203193201Copyright © Головинская О.В., Байкова М.Л., Алпатова Н.А., Зубков Д.А., Фоменко В.В., Гайдерова Л.А., 20202020Головинская О.В., Байкова М.Л., Алпатова Н.А., Зубков Д.А., Фоменко В.В., Гайдерова Л.А.Golovinskaya O.V., Baykova M.L., Alpatova N.A., Zubkov D.A., Fomenko V.V., Gayderova L.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/290

При оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима отечественных и зарубежных производителей биологическим методом in vitro применяются различные виды красителей. Для унификации методики с использованием клеточной культуры, позволяющей оценивать специфическую активность филграстима, важен выбор одного из красителей, используемых для окрашивания клеток. Цель работы: сравнительное изучение красителей тетразолиевого и резазуринового рядов в испытаниях по определению способности филграстима активировать пролиферацию чувствительных клеток. Материалы и методы: использовали клеточную линию NFS-60 (клетки миелолейкоза мышей), 2-й Международный стандарт гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (МСО), красители МТТ, MTS, WST-1, alamarBlue. Оценку пролиферативной активности клеток проводили в условиях in vitro. Уровень пролиферации клеток учитывали по интенсивности флуоресценции или абсорбции. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Origin Pro 9.1. и приложения Microsoft Excel. Результаты: приведена сравнительная характеристика наиболее часто используемых красителей. Описана процедура выбора оптимальных условий проведения испытания с некоторыми из изучаемых красителей. Для анализа потенциальной возможности влияния на конечный результат рассмотрены такие факторы, как продолжительность инкубации клеточной суспензии с МСО и с красителем, состав лизирующего буфера (для окрашивания с помощью МТТ) и различные режимы считывания. Несмотря на то что все изученные красители в заданных условиях испытания позволили получить воспроизводимые кривые «доза–эффект», значения 50% эффективных концентраций статистически значимо не отличались только между испытаниями с использованием трех красителей: МТТ, MTS и alamarBlue (р > 0,05). Выводы: лучшая воспроизводимость результатов была получена в испытаниях с использованием МТТ и alamarBlue. Более простая и менее продолжительная процедура испытания с alamarBlue, отсутствие стадии лизиса клеток и необходимости применения дополнительных реагентов позволяет рекомендовать этот краситель для унификации методики, проводимой в связи с разработкой проекта общей фармакопейной статьи.

Assessment of specific activity of Russian and foreign-made filgrastim products by biological in vitro methods is performed using different types of dyes. It is important to choose one cell staining dye in order to align the procedure of filgrastim specific activity assessment using cell culture. The aim of this study was to perform comparative assessment of tetrazolium and resazurin dyes in tests determining filgrastim ability to activate proliferation of sensitive cells. Materials and methods: NFS-60 (mouse myelogenous leukemia) cell line, 2nd International Standard for Granulocyte Colony Stimulating Factor (IS), as well as МТТ, MTS, WST-1, and alamarBlue dyes were used in the study. Proliferative activity of cells was assessed in vitro. The level of cell proliferation was assessed by fluorescence or absorbance intensity. Origin Pro 9.1. and Microsoft Excel applications were used for statistical processing of the obtained results. Results: the paper compares characteristics of the most widely used dyes. It describes the procedure for choosing optimal test conditions for some of the studied dyes. The authors analysed the potential of some factors, such as duration of cell suspension incubation with IS and with a dye, composition of the lysis buffer (for MTT staining), and different readout modes, to influence the final results. Despite the fact that all the studied dyes gave reproducible dose–response curves under the given test conditions, 50% effective concentrations showed no statistically significant differences in tests with only three dyes: МТТ, MTS, and alamarBlue (р > 0.05). Conclusions: better reproducibility of results was obtained in tests using МТТ and alamarBlue. The test procedure using alamarBlue is easier to perform and less time-consuming, it does not include the cell lysis stage and does not require additional reagents, therefore this dye may be recommended for harmonisation of the test procedure to be elaborated for the Russian Pharmacopoeia.

анализ пролиферации клетокМТТ-тестспецифическая биологическая активность филграстимасоли тетразолияalamarBlueрезазуринMTSWST-1клеточная линия NFS-60гранулоцитарный колониестимулирующий факторcell proliferation assayМТТ testfilgrastim specific biologival activitytetrazolium saltsalamarBlueresazurinMTSWST-1NFS-60 cell linegranulocyte colony stimulating factorРабота выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00003-20-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР АААА-А18-118021590049-0).The study reported in this publication was carried out as part of a publicly funded research project No. 056-00003-20-00 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products (R&D public accounting No. АААА-А18-118021590049-0).ReferencesАникина ЛВ, Пухов СА, Дубровская ЕС, Афанасьева СВ, Клочков СГ. Сравнительное определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ и ресазурина. Фундаментальные исследования. 2014;(12-7):1423–7.Anikina LV, Pukhov SA, Dubrovskaya ES, Afanaseva SV, Klochkov SG. Comparative definition of cell viability by MTT and resazurin. Fundamental’nyye issledovaniya = Fundamental Research. 2014;(12-7):1423–7 (In Russ.)Лягоскин ИВ, Берестовой МА, Потеряев ДА, Зейналова ЭС, Вишневский АЮ, Казаров АА. Валидация XTT-теста для оценки антипролиферативной активности препаратов на основе моноклональных антител. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015;(1):45–50.Lyagoskin IV, Berestovoy MA, Poteryaev DA, Zeinalova ES, Vishnevskiy AY, Kazarov AA. Validation of the XTT-test for assessing the antiproliferative activity of biologics on the basis of monoclonal antibodies. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lecheniye = BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2015;(1):45–50 (In Russ.)Präbst K, Engelhardt H, Ringgeler S, Hübner H. Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and resazurin. In: Gilbert FD, Friedrich O. Cell Viability Assays (Methods and Protocols). Methods in Molecular Biology. Vol. 1601. New York: Humana Press; 2017. P. 1–17. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6960-9_1Präbst K, Engelhardt H, Ringgeler S, Hübner H. Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and resazurin. In: Gilbert FD, Friedrich O. Cell Viability Assays (Methods and Protocols). Methods in Molecular Biology. Vol. 1601. New York: Humana Press; 2017. P. 1–17. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6960-9_1Stoddart JM. Cell viability assays: Introduction. In: Stoddart JM, eds. Mammalian Cell Viability (Methods and Protocols).Methods in Molecular Biology. Vol. 740. New York: Humana Press; 2011. P. 1–6. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-108-6_1Stoddart JM. Cell viability assays: Introduction. In: Stoddart JM, eds. Mammalian Cell Viability (Methods and Protocols).Methods in Molecular Biology. Vol. 740. New York: Humana Press; 2011. P. 1–6. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-108-6_1Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochem. 2018;120(3):159–67. https://doi.org/10.1016/j.acthis.2018.02.005Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochem. 2018;120(3):159–67. https://doi.org/10.1016/j.acthis.2018.02.005Мотузова ЕВ, Алпатова НА, Гайдерова ЛА, Рунова ОБ, Волкова РА, Мыца ЕД и др. Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца активности филграстима. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016;16(3):172–8.Motuzova EV, Alpatova NA, Gayderova LA, Runova OB, Volkova RA, Mytsa ED, et al. Development and certification of an industrial reference standard for determination of filgrastim activity. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lecheniye = BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2016;16(3):172–8 (In Russ.)Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018:095505. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095505Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018:095505. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095505Bopp SK, Lettieri T. Comparison of four different colorimetric and fluorometric cytotoxicity assays in a zebrafish liver cell line. BMC Pharmacol. 2008;8:8. https://doi.org/10.1186/1471-2210-8-8Bopp SK, Lettieri T. Comparison of four different colorimetric and fluorometric cytotoxicity assays in a zebrafish liver cell line. BMC Pharmacol. 2008;8:8. https://doi.org/10.1186/1471-2210-8-8van Tonder A, Joubert AM, Cromarty D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 2015;8:47. https://doi.org/10.1186/s13104-015-1000-8van Tonder A, Joubert AM, Cromarty D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 2015;8:47. https://doi.org/10.1186/s13104-015-1000-8Berridge MV, Herst PM, Tan An S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnol Annu Rev. 2005;11:127–52. https://doi.org/10.1016/S1387-2656(05)11004-7Berridge MV, Herst PM, Tan An S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnol Annu Rev. 2005;11:127–52. https://doi.org/10.1016/S1387-2656(05)11004-7Tiwari K, Wavdhane M, Haque S, Govender T, Kruger GH, Mishra M, et al. A sensitive WST-8-based bioassay for PEGylated granulocyte colony stimulating factor using the NFS-60 cell line. Pharm Biol. 2015;53(6):849–54. https://doi.org/10.3109/13880209.2014.943248Tiwari K, Wavdhane M, Haque S, Govender T, Kruger GH, Mishra M, et al. A sensitive WST-8-based bioassay for PEGylated granulocyte colony stimulating factor using the NFS-60 cell line. Pharm Biol. 2015;53(6):849–54. https://doi.org/10.3109/13880209.2014.943248Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the alamarBlue assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018:095489. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095489Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the alamarBlue assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018:095489. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095489Lall N, Henley-Smith CJ, De Canha MN, Oosthuizen CB, Berrington D. Viability reagent, PrestoBlue, in comparison with other available reagents, utilized in cytotoxicity and antimicrobial assays. Int J Microbiol. 2013;2013:420601. https://doi.org/10.1155/2013/420601Lall N, Henley-Smith CJ, De Canha MN, Oosthuizen CB, Berrington D. Viability reagent, PrestoBlue, in comparison with other available reagents, utilized in cytotoxicity and antimicrobial assays. Int J Microbiol. 2013;2013:420601. https://doi.org/10.1155/2013/420601

The authors declare that there are no conflicts of interest present.