biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2020-20-2-116-125biopreparat-272Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESХарактеризация субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, полученного на основе штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE - продуцента эритропоэтинаCharacterisation of Recombinant Human Erythropoietin Obtained from CHOpE—Erythropoietin Producing Strain of Chinese Hamster Ovary CellsРадаеваИ. Ф.RadaevaI. F.

Радаева Ирина Федоровна

 Irina F. Radaeva

Koltsovo, Novosibirsk Oblast 630559

radaeva@vector.nsc.ruТерновойВ. А.TernovoyV. A.

Терновой Владимир Александрович, канд. биол. наук

 

Vladimir A. Ternovoy, Cand. Sci. (Biol.). 

Koltsovo, Novosibirsk Oblast 630559

tern@vector.nsc.ruСеменцоваА. О.SementsovaA. O.

Семенцова Александра Олеговна

Aleksandra O. Sementsova

Koltsovo, Novosibirsk Oblast 630559

sementsova@vector.nsc.ruДумченкоН. Б.DumchenkoN. B.

Думченко Наталья Борисовна

р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559

Natalya B. Dumchenko

Koltsovo, Novosibirsk Oblast 630559

dumchenko@vector.nsc.ruНечаеваЕ. А.NechaevaE. A.

Нечаева Елена Августовна, канд. мед. наук

р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559

 Elena A. Nechaeva, Cand. Sci. (Med.). 

Koltsovo, Novosibirsk Oblast 630559

nechaeva@vector.nsc.ruФедеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человекаРоссияState Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector”Russian Federation202019052020202116125Copyright © Радаева И.Ф., Терновой В.А., Семенцова А.О., Думченко Н.Б., Нечаева Е.А., 20202020Радаева И.Ф., Терновой В.А., Семенцова А.О., Думченко Н.Б., Нечаева Е.А.Radaeva I.F., Ternovoy V.A., Sementsova A.O., Dumchenko N.B., Nechaeva E.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/272

Разработка и внедрение в клиническую практику препаратов рекомбинантного эритропоэтина человека (рчЭПО) продолжают оставаться актуальными в настоящее время. Для получения разрешения на проведение клинических исследований таблетированной формы рчЭПО для перорального применения проведены дополнительные исследования для подтверждения пригодности штамма-продуцента CHOpE для производства рчЭПО и соответствия характеристик субстанции требованиям, предъявляемым к ЭПО.

Цель работы

Цель работы: характеризация субстанции рчЭПО, полученной на основе клеток штамма продуцента СНОрЕ, в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ЭПО.

Материалы и методы

Материалы и методы: субстанцию рчЭПО получали при культивировании штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE. Экспрессирующую конструкцию штамма-продуцента оценивали с помощью методов определения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Секвенирование нуклеотидной последовательности, кодирующей ген ЭПО человека, проводили по методу Сэнгера. Аминокислотную последовательность С- и N-концов молекулы рчЭПО определяли методом Эдмана. Копийность гена ЭПО в клетках СНОрЕ определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Свойства субстанции рчЭПО изучали в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ЭПО. Подлинность субстанции рчЭПО определяли с помощью методов изоэлектрического фокусирования, пептидного картирования и электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения соотношения изоформного состава использовали метод капиллярного электрофореза. Для выявления примесей димеров и высокомолекулярных родственных веществ в субстанции применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления. Содержание белка и остаточных нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрическим методом. Концентрацию субстанции рчЭПО оценивали методом иммуноферментного анализа.

Результаты

Результаты: подтверждена генетическая стабильность штамма-продуцента СHOpE, доказана идентичность аминокислотной последовательности N- и С-концов молекулы рчЭПО природному ЭПО. На основе штамма-продуцента СHOpE получена субстанция рчЭПО, которая является гомогенной и не содержит примесей олигомерных форм ЭПО. Димеры и высокомолекулярные родственные вещества составляют менее 0,5%. Молекулярная масса рчЭПО находится в диапазоне значений от 32 до 38 кДа, изоэлектрическая точка – от 2,8 до 4,15. Идентифицированы пики изоформ 1–8, изоформный состав субстанции рчЭПО соответствует ЭПО. Установлено, что в 1 моль субстанции содержится 13,75 моль сиаловых кислот.

Выводы

Выводы: подтверждена пригодность штамма-продуцента СНОрЕ для производства рчЭПО. Полученная субстанция рчЭПО соответствует требованиям, предъявляемым к ЭПО.

Development and implementation in clinical practice of recombinant human erythropoietins (rhEPOs) remain a priority task today. Additional studies were performed in order to obtain clinical trial authorisation for rhEPO tablets for oral use. The studies were aimed to demonstrate the suitability of the erythropoietin producer strain based on Chinese hamster ovary cells (CHOpE) for the production of rhEPO, and the compliance of the substance characteristics with the requirements for erythropoietin (EPO).

The aim of the study was to characterise the rhEPO substance obtained from the CHOpE strain cells in accordance with the requirements for EPO.

Materials and methods

Materials and methods: the rhEPO substance was obtained by culturing the strain of Chinese hamster ovary cells—CHOpE. The expression construct of the producer strain was evaluated using methods for determination of nucleotide and amino acid sequences. The Sanger method was used to perform sequencing of the nucleotide sequence encoding the human EPO gene. The amino acid sequences of the rhEPO molecule C- and N-termini were determined by the Edman method. The copy number of the EPO gene in CHOpE cells was determined by real-time polymerase chain reaction. The properties of the rhEPO substance were evaluated in accordance with the requirements for EPO. Isoelectric focusing, peptide mapping, and polyacrylamide gel electrophoresis were used for identification of the rhEPO substance. The ratio of isoform composition was determined by capillary electrophoresis. Dimer impurities and high molecular weight related substances were determined by high-pressure liquid chromatography. The content of protein and residual nucleic acids was determined by spectrophotometry. The concentration of the rhEPO substance was assessed by enzyme immunoassay.

The results of the study confirmed genetic stability of the CHOpE producer strain and demonstrated identity of N- and C-terminal amino acid sequences of the rhEPO molecule to those of the natural EPO. The CHOpE producer strain was used to obtain a rhEPO substance which is homogenous and does not contain impurities of EPO oligomeric forms. Dimers and high molecular weight related substances account for less than 0.5%. The rhEPO molecular weight ranges from 32 to 38 kDa, and the isoelectric point is within 2.8—4.15. The study identified the peaks of isoforms 1–8, the isoform composition of the rhEPO substance corresponds to that of EPO. It was determined that 1 mol of the substance contains 13.75 mols of sialic acids.

Conclusions

Conclusions: the study confirmed the suitability of the CHOpE producer strain for the production of rhEPO. The obtained rhEPO substance meets requirements for EPO. 

продуцент эритропоэтинаштамм клеток СHOpEнуклеотидная последовательностьмолекулярная массаподлинностьпептидное картированиедимерысиаловые кислотыerythropoietin producerCHOpE cell strainnucleotide sequencemolecular weightidentificationpeptide mappingdimerssialic acidsReferencesMelli G, Jack C, Lambrinos GL, Ringkamp M, Höke A. Erythropoietin protects sensory axons against paclitaxel-induced distal degeneration. Neurobiol. Dis. 2006;24(3):525–30. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2006.08.014Melli G, Jack C, Lambrinos GL, Ringkamp M, Höke A. Erythropoietin protects sensory axons against paclitaxel-induced distal degeneration. Neurobiol. Dis. 2006;24(3):525–30. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2006.08.014Lisowska KA, Bryl E, Witkowski JM. Erythropoietin receptor is detectable on peripheral blood lymphocytes and its expression increases in activated T lymphocytes. Haematologica. 2011;96(3):e12–e13. https://doi.org/10.3324/haematol.2010.038414Lisowska KA, Bryl E, Witkowski JM. Erythropoietin receptor is detectable on peripheral blood lymphocytes and its expression increases in activated T lymphocytes. Haematologica. 2011;96(3):e12–e13. https://doi.org/10.3324/haematol.2010.038414Heeschen C, Aicher A, Lehmann R, Fichtlscherer S, Vasa M, Urbich C, et al. Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization. Blood. 2003;102(4):1340–6. https://doi.org/10.1182/blood-2003-01-0223Heeschen C, Aicher A, Lehmann R, Fichtlscherer S, Vasa M, Urbich C, et al. Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization. Blood. 2003;102(4):1340–6. https://doi.org/10.1182/blood-2003-01-0223Savino C, Pedotti R, Baggi F, Ubiali F, Gallo B, Nava S, et al. Delayed administration of erythropoietin and its non-erythropoietic derivatives ameliorates chronic murine autoimmune encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 2006;172(1–2):27–37. https://doi.org/10.1016/j.jneuroim.2005.10.016Savino C, Pedotti R, Baggi F, Ubiali F, Gallo B, Nava S, et al. Delayed administration of erythropoietin and its non-erythropoietic derivatives ameliorates chronic murine autoimmune encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 2006;172(1–2):27–37. https://doi.org/10.1016/j.jneuroim.2005.10.016Киприянов СМ, Царева АА, Офицеров ВИ, Хромых ТИ, Сандахчиев ЛС. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSV-dEp-poly-NeO, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка CHOpE – продуцент эритропоэтина человека. Патент Российской Федерации № 2070931; 1996.Kiprijanov SM, Tsareva AA, Offitserov VI, Khromykh TI, Sandakhchiev LS. Recombinant plasmid DNA pSV-dEp-poly-NeO encoding human erythropoietin, strain of Chinese hamster ovary cultured cell CHOpE – a producer of human erythropoietin. Patent of the Russian Federation No. 2070931; 1996 (In Russ.)]Радаева ИФ, Богрянцева МП, Нечаева ЕА. Банки культур клеток для биотехнологии. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012;(2):110–5.Радаева ИФ, Богрянцева МП, Нечаева ЕА. Банки культур клеток для биотехнологии. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012;(2):110–5. [Radaeva IF, Bogryanceva MP, Nechaeva EA. Cell Culture Banks for Biotechnology. Kletochnye tekhnologii v biologii i medicine= Cell Technologies in Biology and Medicine. 2012;(2):110–5 (In Russ.)Радаева ИФ, Колесова МЕ, Сереброва ВС, Вараксин НА, Рябичева ТГ, Жилина НВ, Нечаева ЕА. Разработка технологии получения лиофилизованной субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека. Биотехнология. 2013;29(2):67–73.Radaeva IF, Kolesova ME, Serebrova VS, Varaksin NA, Ryabicheva TG, Zhilina NV, Nechaeva EA. Development of technology for production of recombinant human erythropoetin freeze-dried substance. Biotekhnologiya = Biotechnology. 2013;29(2):67–73 (In Russ.)Сандахчиев ЛС, Колокольцова ТД, Костина НЕ, Нечаева ЕА, Юрченко НД, Рыжиков АБ и др. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения и способ ее получения. Патент Российской Федерации № 2152206; 2000.Sandakhchiev LS, Kolokoltsova TD, Kostina NE, Nechaeva EA, Yurchenko ND, Ryzhikov AB, et al. Tabletted form of recombinant human erythropoietin for oral use and method of its preparing. Patent of the Russian Federation No. 2152206; 2000 (In Russ.)Ханисов ВВ, Тритэк ВС, Акапов АБ, Буркитбаева СС, Джунушалиева ЧУ, Хасенбекова ЖР и др. Влияние субстанции рекомбинантного человеческого эритропоэтина на гематологические показатели в периферической крови. Биотехнология. Теория и практика. 2007;(2):101–8.Hanisov VV, Tritek VS, Akapov AB, Burkitbaeva SS, Dzhunushalieva ChU, Hasenbekova ZhR, et al. The effect of the substance of recombinant human erythropoietin on hematological parameters in peripheral blood. Biotekhnologiya. Teoriya i praktika= Biotechnology. Theory and practice. 2007;(2):101–8 (In Russ.)Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463–7. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463–7. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463Lin FK, Suggs S, Lin CH, Browne JK, Smalling R, Egrie JC, et al. Cloning and expression of the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985;82(22):7580–4. https://doi.org/10.1073/pnas.82.22.7580Lin FK, Suggs S, Lin CH, Browne JK, Smalling R, Egrie JC, et al. Cloning and expression of the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985;82(22):7580–4. https://doi.org/10.1073/pnas.82.22.7580Малыгина ВС, Радаева ИФ, Нечаева ЕА, Дроздов ИГ. Изучение свойств культуры клеток CHOpE – продуцента эритропоэтина человека. Биотехнология. 2010;2:31–5.Malygina VS, Radaeva IF, Nechaeva EA, Drozdov IG. Characteristics of a cell culture CHO-pE, a producer of human erythropoietin. Biotekhnologiya = Biotechnology. 2010;2:31–5 (In Russ.)Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G, Chasin LA. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75(11):5553–6. https://doi.org/10.1073/pnas.75.11.5553Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G, Chasin LA. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75(11):5553–6. https://doi.org/10.1073/pnas.75.11.5553Меркулов ВА, Солдатов АА, Авдеева ЖИ, Алпатова НА, Гайдерова ЛА, Яковлев АК и др. Препараты рекомбинантных эритропоэтинов и их характеристика. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2013;(3):4–11Merkulov VA, Soldatov AА, Avdeeva ZhI, Alpatova NA, Gayderova LA, Yakovlev AK, et al. Recombinant erythropoietin preparations and their characteristics. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie = BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2013;(3):4–11 (In Russ.)Яковлев АК, Алешкин АВ, Меркулов ВА, Бондарев ВП. Совершенствование методики определения специфической активности эритропоэтина. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63(7):422–8.Yakovlev AK, Aleshkin AV, Merkulov VA, Bondarev VP. Improvement of erythropoietin bioassay. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics. 2018;63(7):422–8 (In Russ.)Яковлев АК, Волкова РА, Симутенко ЛВ, Постнова ЕЛ, Батуашвили ТА, Воропаев АА и др. Разработка отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина. Химико-фармацевтический журнал. 2018;52(1):60–4.Yakovlev AK, Volkova RA, Simutenko LV, Postnova EL, Batuashvili TA, Voropaev AA, et al. Development of industrial reference sample of the specific activity of erythropoietin. Khimiko-farmatsevticheskiy zhurnal = Pharmaceutical Chemistry Journal. 2018;52(1):60–4 (In Russ.) https://doi.org/10.30906/0023-1134-2018-52-1-60-64

The authors declare that there are no conflicts of interest present.