biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2019-19-4-261-267biopreparat-214Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESАпробация методики эксклюзионной хроматографии для оценки молекулярных параметров иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадейExperimental Testing of a Size-Exclusion Chromatography Method Used for Evaluation of Molecular Parameters of Equine Anti-Ebola ImmunoglobulinМишаловаЕ. Ю.MishalovaЕ. Yu.

Мишалова Екатерина Юрьевна

ул. Октябрьская, д. 11, Сергиев Посад-6, Московская область, 141306

Ekaterina Yu. Mishalova

11 Oktyabr’skaya St., Sergiev Posad-6, Moscow Region 141306

48cnii@mil.ruГордеевЕ. В.GordeevE. V.

Гордеев Евгений Васильевич

ул. Октябрьская, д. 11, Сергиев Посад-6, Московская область, 141306

Evgeniy V. Gordeev

11 Oktyabr’skaya St., Sergiev Posad-6, Moscow Region 141306

48cnii@mil.ruЛебедевВ. Н.LebedevV. N.

Лебедев Виталий Николаевич, д-р биол. наук, проф.

ул. Октябрьская, д. 11, Сергиев Посад-6, Московская область, 141306

Vitaly N. Lebedev, Dr. Sci. (Biol.), Professor

11 Oktyabr’skaya St., Sergiev Posad-6, Moscow Region 141306

48cnii@mil.ruМельниковС. А.MelnikovS. A.

Мельников Сергей Алексеевич, канд. биол. наук, ст. науч. сотр.

ул. Октябрьская, д. 11, Сергиев Посад-6, Московская область, 141306

Sergey А. Melnikov, Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate

11 Oktyabr’skaya St., Sergiev Posad-6, Moscow Region 141306

48cnii@mil.ruНимирскаяС. А.NimirskayaS. A.

Нимирская Светлана Александровна, канд. мед. наук

ул. Октябрьская, д. 11, Сергиев Посад-6, Московская область, 141306

Svetlana А. Nimirskaya, Cand. Sci. (Med.)

11 Oktyabr’skaya St., Sergiev Posad-6, Moscow Region 141306

48cnii@mil.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6742-3919БорисевичС. В.BorisevichS. V.

Борисевич Сергей Владимирович, д-р биол. наук, проф., член-корр. РАН

ул. Октябрьская, д. 11, Сергиев Посад-6, Московская область, 141306

Sergey V. Borisevich, Dr. Sci. (Biol.), Professor, Corr. Member of RAS.

11 Oktyabr’skaya St., Sergiev Posad-6, Moscow Region 141306

48cnii@mil.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской ФедерацииРоссия48 Central Scientific Research InstituteRussian Federation201913112019194261267Copyright © Мишалова Е.Ю., Гордеев Е.В., Лебедев В.Н., Мельников С.А., Нимирская С.А., Борисевич С.В., 20192019Мишалова Е.Ю., Гордеев Е.В., Лебедев В.Н., Мельников С.А., Нимирская С.А., Борисевич С.В.Mishalova Е.Y., Gordeev E.V., Lebedev V.N., Melnikov S.A., Nimirskaya S.A., Borisevich S.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/214

Геморрагическая лихорадка, вызываемая вирусом Эбола, является особо опасным вирусным инфекционным заболеванием, характеризующимся летальным исходом в 50–90 % случаев. Важными компонентами рассматриваемого ВОЗ спектра медицинских средств экстренной профилактики и лечения заболевания являются гетерологичные иммуноглобулины с высоким титром вируснейтрализующих антител. Специфическая активность указанных препаратов во многом определяется их фракционным составом, в том числе молекулярно-массовым распределением. Для оценки молекулярно-массового распределения целевого белка в препаратах на основе иммуноглобулина человека традиционно применяется методика эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использование данной методики для оценки молекулярных параметров гетерологичного иммуноглобулина требует подтверждения специфичности, правильности и прецизионности, а также определения критериев пригодности хроматографической системы применительно к новому объекту. Цель работы: апробация методики эксклюзионной ВЭЖХ для оценки молекулярных параметров иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей. Материалы и методы: в работе использовали три серии очищенного иммуноглобулина против лихорадки Эбола, выделенного из сыворотки крови лошадей. В качестве стандартных образцов использовали нормальные лошадиный и человеческий иммуноглобулины изотипа IgG. Определение содержания мономеров и других фракций иммуноглобулина с помощью ВЭЖХ проводили с использованием методик, представленных в Европейской фармакопее 9.6 и Государственной фармакопее Российской Федерации XIV изд. Для хроматографической оценки качества изучаемых препаратов использовали хроматограф Agilent 1260 Infinity (Agilent, США) c диодно-матричным детектором и хроматографическую колонку Agilent Bio SEC-3. Результаты: установлено, что используемая система эксклюзионной ВЭЖХ по показателям фактора разрешения между хроматографическими пиками мономера и димера IgG (1,69 и 2,10) и эффективности хроматографической колонки (>2000) может быть использована для оценки молекулярных параметров гетерологичного иммуноглобулина. Подтверждена воспроизводимость результатов методики. Выводы: апробирована методика эксклюзионной ВЭЖХ для оценки молекулярных параметров иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей. Установлено соответствие качества очищенного иммуноглобулина отечественным и международным требованиям по показателю «Молекулярные параметры».

Haemorrhagic fever caused by the Ebola virus is a highly hazardous infectious disease with a mortality rate of 50– 90 %. Heterologous immunoglobulins with a high virus-neutralizing titer are an important element of the WHO-endorsed set of measures for emergency prevention and treatment of the disease. Specific activity of these products is largely determined by their fractional composition, and, in particular, by molecular mass distribution (MMD). The size-exclusion-high-performance liquid chromatography (SEC-HPLC) has traditionally been used for determination of the MMD of the target protein in human immunoglobulin-based products. The use of this method for evaluation of molecular parameters of heterologous immunoglobulin requires confirmation of its specificity, accuracy and precision, and establishment of the chromatographic system suitability criteria in the context of a new test object. The aim of the study was to test the applicability of the SEC-HPLC method to the assessment of molecular parameters of anti-Ebola immunoglobulin derived from horse serum. Materials and methods: three batches of purified equine anti-Ebola immunoglobulin were used in the study. Normal equine and human immunoglobulins of the IgG isotype were used as reference standards. The HPLC test procedures described in the European Pharmacopoeia 9.6 and State Pharmacopoeia of the Russian Federation, 14th ed., were used for determination of monomers and other immunoglobulin fractions. An Agilent 1260 Infinity (Agilent, USA) HPLC system with a diode array detector and an Agilent Bio SEC-3 HPLC column were used for quality evaluation of the tested products. Results: the resolution factor between IgG monomer and dimer peaks (1.69 and 2.10), and the chromatographic column efficiency (>2000) make it possible to use the SEC-HPLC system for evaluation of molecular parameters of heterologous immunoglobulin. The study demonstrated reproducibility of the test procedure. Conclusions: the study confirmed the applicability of the SEC-HPLC procedure for evaluation of molecular parameters of anti-Ebola immunoglobulin derived from horse serum. It demonstrated the compliance of the purified immunoglobulin to the national and international quality requirements in terms of «Molecular parameters».

гетерологичный иммуноглобулинвирус Эболамолекулярные параметры иммуноглобулинавысокоэффективная жидкостная хроматографияоценка качествакритерии пригодности хроматографической системыheterologous immunoglobulinEbola virusimmunoglobulin molecular parametershigh performance liquid chromatographyquality controlchromatographic system suitability criteriaИсследование проводилось без спонсорской поддержки.ReferencesFeldmann H, Geisbert TW. Ebola haemorrhagic fever. Lancet. 2011;377(9768):849–62. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)60667-8Feldmann H, Geisbert TW. Ebola haemorrhagic fever. Lancet. 2011;377(9768):849–62. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)60667-8Dowall SD, Callan J, Zeltina A, Al-Abdulla I, Strecker T, Fehling SK, et al. Development of a cost-effective ovine polyclonal antibody-based product, EBOTAb, to treat Ebola virus infection. J Infect Dis. 2016;213(7):1124–33. https://doi.org/10.1093/infdis/jiv565Dowall SD, Callan J, Zeltina A, Al-Abdulla I, Strecker T, Fehling SK, et al. Development of a cost-effective ovine polyclonal antibody-based product, EBOTAb, to treat Ebola virus infection. J Infect Dis. 2016;213(7):1124–33. https://doi.org/10.1093/infdis/jiv565Борисевич ИВ, Краснянский ВП, Михайлов ВВ, Потрываева НВ, Градобоев ВН, Тиманькова ГД, Карелов ЮМ. Разработка и получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола. В кн: Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций. Кольцово; 1993. С. 44.Borisevich IV, Krasnyanskiy VP, Mikhaylov VV, Potryvaeva NV, Gradoboev VN, Timan’kova GD, Karelov YuM. Development and production of immunoglobulin against Ebola. In: The study and prevention of especially dangerous viral infections. Koltsovo; 1993. P. 44 (In Russ.)Maruyama T, Rodriguez LL, Jahrling PB, Sanchez A, Khan AS, Nichol ST, et al. Ebola virus can be effectively neutralized by antibody produced in natural human infection. J Virol. 1999;73(7):6024–30.Maruyama T, Rodriguez LL, Jahrling PB, Sanchez A, Khan AS, Nichol ST, et al. Ebola virus can be effectively neutralized by antibody produced in natural human infection. J Virol. 1999;73(7):6024–30.Михайлов ВВ, Борисевич ИВ, Тиманькова ГД, Краснянский ВП, Потрываева НВ, Лебединская ЕВ, Черникова НК. Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки Эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкий (иммуноглобулин Эбола). Патент Российской Федерации № 2130318; 1999.Mikhaylov VV, Borisevich IV, Timan’kova GD, Krasnyanskiy VP, Potryvaeva NV, Lebedinskaya EV, Chernikova NK. Preparation containing immunoglobulin against Ebola fever from horse blood serum and liquid (Ebola immunoglobulin). Patent of the Russian Federation No. 2130318; 1999 (In Russ.)Борисевич ИВ, Черникова НК, Марков ВИ, Краснянский ВП, Борисевич СВ, Рождественский ЕВ. Опыт клинического применения специфического иммуноглобулина из сыворотки крови лошадей в качестве средства экстренной профилактики лихорадки Эбола. Вопросы вирусологии. 2017;62(1):25–9.Borisevich IV, Chernikova NK, Markov VI, Krasnianskiy VP, Borisevich SV, Rozhdestvenskiy EV. An experience in the clinical use of specific immunoglobulin from horse blood serum for prophylaxis of Ebola haemorrhagic fever. Voprosy virusologii = Problems of Virology. 2017;62(1):25–9 (In Russ.)Fernandes A, Kaundinya JO, Daftary G, Saxena L, Banerjee S, Pattnaik P. Chromatographic purification of equine immunoglobulin G F(ab)2 from plasma. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008;876(1):109–15. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2008.10.030Fernandes A, Kaundinya JO, Daftary G, Saxena L, Banerjee S, Pattnaik P. Chromatographic purification of equine immunoglobulin G F(ab)2 from plasma. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008;876(1):109–15. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2008.10.030Попова АЮ, Демина ЮВ, Смоленский ВЮ, Гордеев ЕВ, Рождественский ЕВ, Краснянский ВП и др. Способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого. Патент Российской Федерации № 2673546; 2018.Popova AYu, Demina YuV, Smolenskiy VYu, Gordeev EV, Rozhdestvenskiy EV, Krasnyanskiy VP, et al. Method for producing liquid immunoglobulin against Ebola fever from horse blood serum. Patent of the Russian Federation No. 2673546; 2018 (In Russ.)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.