biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2019-19-1-39-49biopreparat-207Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESФизико-химические и биологические свойства биоподобного и референтного препаратов тканевого активатора плазминогенаPhysico-Chemical and Biological Properties of Biosimilar and Reference Tissue Plasminogen Activator ProductsГусароваВ. Д.GusarovaV. D.

канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела аналитических методов ООО «Международный биотехнологический центр «ГЕНЕРИУМ»

Candidate of Biological Sciences, Senior Scientist of the Analytical Methods Department of the International Biotechnology Center «GENERIUM»

ПантюшенкоМ. С.PantyushenkoM. S.

канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела аналитических методов

Candidate of Biological Sciences, Senior Scientist of the Analytical Methods Department

https://orcid.org/0000-0002-0879-5595СимоновВ. М.SimonovV. M.

научный сотрудник отдела аналитических методов

Scientist of the Analytical Methods Department

https://orcid.org/0000-0002-6532-7835ШукуровР. Р.ShukurovR. R.

канд. биол. наук, начальник лаборатории физико-химических методов отдела аналитических методов

Candidate of Biological Sciences, Head of Laboratory of Physicochemical Methods, Analytical Methods Department

https://orcid.org/0000-0002-1314-894XХамитовР. А.KhamitovR. A.

д-р мед. наук, профессор, генеральный директор

Doctor of Medical Science, Professor, General Director

https://orcid.org/0000-0002-7865-9361ВишневскийА. Ю.VishnevskiyA. Yu.

канд. биол. наук, начальник отдела аналитических методов

Candidate of Biological Sciences, Head of the Analytical Methods Department

vishnevskiy@ibcgenerium.ruОбщество с ограниченной ответственностью «Международный биотехнологический центр «ГЕНЕРИУМ»РоссияInternational Biotechnology Center «GENERIUM»Russian Federation2019250220191913949Copyright © Гусарова В.Д., Пантюшенко М.С., Симонов В.М., Шукуров Р.Р., Хамитов Р.А., Вишневский А.Ю., 20192019Гусарова В.Д., Пантюшенко М.С., Симонов В.М., Шукуров Р.Р., Хамитов Р.А., Вишневский А.Ю.Gusarova V.D., Pantyushenko M.S., Simonov V.M., Shukurov R.R., Khamitov R.A., Vishnevskiy A.Y.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/207

Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (международное непатентованное название — алтеплаза), разработанный и зарегистрированный компанией АО «ГЕНЕРИУМ» (Россия), является полным аналогом лекарственного препарата Актилизе®, используемого для лечения заболеваний, сопровождающихся тромбообразованием, таких как инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии и ишемический инсульт. Цель работы: провести комплексное исследование сопоставимости физико-химических и биологических характеристик лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе® для оценки их биоподобия. Материалы и методы: сравнительное пептидное картирование с определением сопоставимости хроматографических профилей триптических гидролизатов проводилось методами ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрии, определение молекулярно-массового распределения — методами масс-спектрометрии и электрофореза в полиакриламидном геле по Леммли. Для определения чистоты и гомогенности препаратов, а также содержания родственных примесей (олигомеров, фрагментов) использовали метод гель-фильтрации; исследование профиля N-гликозилирования осуществляли методом гидрофильной ВЭЖХ, определение тотального содержания сиаловых кислот — методом Свеннерхольма. Оценку связывания белка с фибрином и фибриногеном человека проводили методом поверхностного плазмонного резонанса, сравнение специфической активности — методом лизиса фибринового сгустка. Результаты: в ходе исследований было продемонстрировано полное совпадение пептидных карт анализируемых препаратов, что свидетельствует об идентичности аминокислотной последовательности алтеплазы в составе сравниваемых препаратов. Также сравнительно были определены молекулярная масса и содержание интактной одноцепочечной формы белка в лекарственных препаратах, количественно охарактеризованы посттрансляционные модификации, содержание сиаловых кислот и нейтральных сахаров. При изучении профиля N-гликозилирования обнаружены незначительные различия в процентном содержании мультиантенных комплексных гликанов. Специфичность алтеплазы оценивали при образовании белковых комплексов с природными лигандами алтеплазы — фибрином и ингибитором активатора плазминогена первого типа, при этом достоверных различий обнаружено не было. При сравнении специфической активации фибринолитической активности плазминогена в тесте на скорость лизиса фибринового сгустка была продемонстрирована сопоставимость препаратов Ревелиза® и Актилизе®. Выводы: проведенные сравнительные экспериментальные исследования показали отсутствие различий в структуре, гетерогенности распределения зарядов, содержании примесей, а также специфической активности алтеплазы в составе лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе®, что позволяет сделать вывод о сопоставимости препаратов по физико-химическим и биологическим свойствам.

Recombinant tissue plasminogen activator (international nonproprietary name — alteplase) which was developed by «GENERIUM» (Russia) and received a marketing authorisation in Russia is completely analogous to Actilyse® which is used to treat medical conditions accompanied by thrombosis, such as acute myocardial infarction, pulmonary embolism, and ischemic stroke. The aim of the study was to carry out a comprehensive comparison of physico-chemical and biological properties of Revelyse® and the reference product Actilyse® in order to assess their biosimilarity. Materials and Methods: comparative peptide mapping and determination of comparability of chromatographic profiles of tryptic hydrolysates was performed using RP-HPLC and massspectrometry; the molecular weight distribution was determined by mass-spectrometry and polyacrylamide gel electrophoresis (Laemmli method). The purity and homogeneity of products as well as the content of related impurities (oligomers and fragments) were determined using gel filtration; N-glycosylation profile was analysed by hydrophilic HPLC, total sialic acid was quantified by the Svennerholm resorcinol method. Protein binding to fibrin and human fibrinogen was assessed by surface plasmon resonance, and the specific activity was compared by fibrin clot lysis. Results: the research demonstrated a complete overlap of the products’ peptide maps, which indicates the identity of аlteplase amino acid sequences in the two medicines being compared. The authors of the study also determined the molecular weight and the content of the intact single-stranded form of the protein, and quantified post-translational modifications, the content of sialic acids and neutral sugars. The analysis of the N-glycosylation profile revealed insignificant differences in the percentage of multiantenna complex glycans. The specificity of alteplase was evaluated by analysing the formation of protein complexes with natural alteplase ligands – fibrin and plasminogen activator inhibitor-1, but no significant differences were found. The comparison of specific activation of plasminogen fibrinolytic activity was performed based on the results of the assay analysing the fibrin clot lysis rate, and it demonstrated comparability of Revelyse® and Actilyse®. Conclusions: comparative experimental studies have shown no differences in the structure, charge distribution heterogeneity, impurities content, and specific activity of alteplase as a component of Revelyse® and the reference product Actilyse®, which leads to the conclusion that they are similar in terms of physicochemical and biological properties.

тканевый активатор плазминогенабиоаналогАктилизе®Ревелиза®профиль гликозилированияпосттрансляционные модификациилизис фибринового сгусткаtissue plasminogen activatorbiosimilarActilyse®Revelyse®glycosylation profilepost-translational modificationsfibrin clot lysisВыражаем благодарность всему коллективу отдела аналитических методов МБЦ «ГЕНЕРИУМ» за советы и поддержку в работе над проектом. Научному сотруднику М.А. Смолову за разработку методов анализа гликанов и важные замечания к статье. Исследование проводилось без спонсорской поддержки.ReferencesGuzzetta AW, Basa LJ, Hancock WS, Keyt BA, Bennett WF. Identification of carbohydrate structures in glycoprotein peptide maps by the use of LC/MS with selected ion extraction with special reference to tissue plasminogen activator and a glycosylation variant produced by site directed mutagenesis. Anal Chem. 1993;65(21):2953–62.Guzzetta AW, Basa LJ, Hancock WS, Keyt BA, Bennett WF. Identification of carbohydrate structures in glycoprotein peptide maps by the use of LC/MS with selected ion extraction with special reference to tissue plasminogen activator and a glycosylation variant produced by site directed mutagenesis. Anal Chem. 1993;65(21):2953–62.Spellman MW, Basa LJ, Leonard CK, Chakel JA, O’ConnorJV, Wilson S, van Halbeek H. Carbohydrate structures of human tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 1989;264(24):14100–11.Spellman MW, Basa LJ, Leonard CK, Chakel JA, O’ConnorJV, Wilson S, van Halbeek H. Carbohydrate structures of human tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 1989;264(24):14100–11.Harris RJ, Leonard CK, Guzzetta AW, Spellman MW. Tissue plasminogen activator has an O-linked fucose attached to threonine-61 in the epidermal growth factor domain. Biochemistry. 1991;30(9):2311–4.Harris RJ, Leonard CK, Guzzetta AW, Spellman MW. Tissue plasminogen activator has an O-linked fucose attached to threonine-61 in the epidermal growth factor domain. Biochemistry. 1991;30(9):2311–4.Parekh RB, Dwek RA, Thomas JR, Opdenakker G, Rademacher TW, Wittwer AJ, et al. Cell-type-specific and site-specific N-glycosylation of type I and type II human tissue plasminogen activator. Biochemistry. 1989;28(19):7644–62.Parekh RB, Dwek RA, Thomas JR, Opdenakker G, Rademacher TW, Wittwer AJ, et al. Cell-type-specific and site-specific N-glycosylation of type I and type II human tissue plasminogen activator. Biochemistry. 1989;28(19):7644–62.Wittwer AJ, Howard SC, Carr LS, Harakas NK, Feder J, Parekh RB, et al. Effects of N-glycosylation on in vitro activity of Bowes melanoma and human colon fibroblast derived tissue plasminogen activator. Biochemistry. 1989;28(19):7662–9.Wittwer AJ, Howard SC, Carr LS, Harakas NK, Feder J, Parekh RB, et al. Effects of N-glycosylation on in vitro activity of Bowes melanoma and human colon fibroblast derived tissue plasminogen activator. Biochemistry. 1989;28(19):7662–9.Berg DT, Burck PJ, Berg DH, Grinnell BW. Kringle glycosylation in a modified human tissue plasminogen activator improves functional properties. Blood. 1993;81(5):1312–22.Berg DT, Burck PJ, Berg DH, Grinnell BW. Kringle glycosylation in a modified human tissue plasminogen activator improves functional properties. Blood. 1993;81(5):1312–22.Cole ES, Nichols EH, Poisson L, Harnois ML, Livingston DJ. In vivo clearance of tissue plasminogen activator: The complex role of sites of glycosylation and level of sialylation. Fibrinilysis. 1993;7(1):15–22. https://doi.org/10.1016/0268-9499(93)90050-6Cole ES, Nichols EH, Poisson L, Harnois ML, Livingston DJ. In vivo clearance of tissue plasminogen activator: The complex role of sites of glycosylation and level of sialylation. Fibrinilysis. 1993;7(1):15–22. https://doi.org/10.1016/0268-9499(93)90050-6Chloupek RC, Harris RJ, Leonard CK, Keck RG, Keyt BA, Spellman MW, et al. Study of the primary structure of recombinant tissue plasminogen activator by reversedphase high-performance liquid chromatographic tryptic mapping. J Chromatogr. 1989;463(2):375–96.Chloupek RC, Harris RJ, Leonard CK, Keck RG, Keyt BA, Spellman MW, et al. Study of the primary structure of recombinant tissue plasminogen activator by reversedphase high-performance liquid chromatographic tryptic mapping. J Chromatogr. 1989;463(2):375–96.Kim PY, Tieu LD, Stafford AR, Fredenburgh JC, Weitz JI. A high affinity interaction of plasminogen with fibrin is not essential for efficient activation by tissue-type plasminogen activator. J Biol Chem. 2012;287(7):4652–61. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.317719Kim PY, Tieu LD, Stafford AR, Fredenburgh JC, Weitz JI. A high affinity interaction of plasminogen with fibrin is not essential for efficient activation by tissue-type plasminogen activator. J Biol Chem. 2012;287(7):4652–61. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.317719Björquist P, Brohlin M, Ehnebom J, Ericsson M, Kristansen C, Pohl G, Deinum J. Plasminogen activator inhibitor type-1 interacts exclusively with the proteinase domain of tissue plasminogen activator. Biochim Biophys Acta. 1994;1209(2):191–202.Björquist P, Brohlin M, Ehnebom J, Ericsson M, Kristansen C, Pohl G, Deinum J. Plasminogen activator inhibitor type-1 interacts exclusively with the proteinase domain of tissue plasminogen activator. Biochim Biophys Acta. 1994;1209(2):191–202.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.