biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Productsbiopreparat-100Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESИзучение возможности использования метода qPCR для контроля отсутствия микоплазменной контаминации в клеточных культурахPossibilities of qPCR control of mycoplasma contamination of cell culturesЁлшинН. Д.YolshinN. D.

Младший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии

Junior research scientist of the Immunopharmacology Laboratory

nikita.yolshin@gmail.comПетровА. В.PetrovA. V.

Начальник лаборатории иммунофармакологии

Head of the Immunopharmacology Laboratory

noemail@neicon.ruГосударственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратовРоссияState Research Institute of Highly Pure BiopreparationsRussian Federation201720022018173173179Copyright © Ёлшин Н.Д., Петров А.В., 20182018Ёлшин Н.Д., Петров А.В.Yolshin N.D., Petrov A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/100

Микоплазмы - основные контаминанты клеточных культур. Персистируя в клеточных культурах, микоплазмы многообразно влияют на функционирование клеток-хозяев. Проведение экспериментов на таких контаминированных клетках нерационально, как и наработка в них белка. Цель работы - изучить возможность быстрого выявления контаминации микоплазмами культур клеток и биотехнологических продуктов с воспроизведением ранее разработанной методики, при внесении в нее упрощающих модификаций, повышающих доступностность такого анализа в России, а также оценить возможность валидации методики для контроля в процессе производства. Из уже существующих методик детекции микоплазмы методом qPCR (quantitative PCR) была выбрана наиболее пригодная для работы, произведена модификация анализа: дорогостоящие и недоступные к синтезу в России MGB-зонды были заменены на обычные флуоресцентные. Воспроизводимость и чувствительность модифицированной методики были изучены на примере работы с M. hominis. Чувствительность данного теста достигает 10 генных копий микоплазм на реакцию. На основании сопоставления полученных результатов и регламентируемых нормативными документами требований к методам детекции микоплазм сделан вывод, что предложенная методика на основе qPCR анализа хорошо подходит для своевременной и регулярной проверки культур клеток на предмет контаминации микоплазмами, теоретически нет никаких противоречий с современной регламентирующей документацией для использования этого метода в качестве основного.

Mycoplasmas are the main contaminants of cells cultures. They persist in cell cultures and can extensively affect host cell functions. Conducting experiments or producing protein in contaminated cultures are impractical. The aim of the study was to explore the possibility of quick detection of mycoplasma contamination of cell cultures and biotechnological products by a previously developed method which was modified to make it simpler and more affordable in Russia; and to assess the possibility of method validation for quality control. The authors chose the most applicable qPCR method of all qPCR methods currently used for mycoplasma detection, and modified it in the following way: expensive MGB-probes which cannot be synthesized in Russia were substituted by ordinary fluorescence probes. The reproducibility and sensitivity of the modified method were tested with M. hominis. The sensitivity of the test was equal to 10 mycoplasma gene copies per reaction. Comparison of the obtained results with regulatory requirements for mycoplasma detection showed that the proposed method complies with current official requirements and could be used as the main method for routine prompt cell culture testing for mycoplasma contamination.

микоплазмыконтаминация клеточных культурqPCR определение микоплазмконтроль качества биотехнологических продуктовmycoplasmacell culture contaminationqPCR mycoplasma detectionbiotechnological products quality controlReferencesLangdon SP. Cell culture contamination: an overview. Methods Mol Med. 2004; 88: 309-17.Langdon SP. Cell culture contamination: an overview. Methods Mol Med. 2004; 88: 309–17.Uphoff CC, Denkmann SA, Drexler HG. Treatment of mycoplasma contamination in cell cultures with Plasmocin. J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 267678.Uphoff CC, Denkmann SA, Drexler HG. Treatment of mycoplasma contamination in cell cultures with Plasmocin. J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 267678.Rottem S, Barile MF. Beware of mycoplasmas. Trends Biotechnol. 1993; 11(4): 143-51.Rottem S, Barile MF. Beware of mycoplasmas. Trends Biotechnol. 1993; 11(4): 143–51.Stemke GW, Robertson JA. Comparison of two methods for enumeration of mycoplasmas. J Clin Microbiol. 1982; 16(5): 959-61.Stemke GW, Robertson JA. Comparison of two methods for enumeration of mycoplasmas. J Clin Microbiol. 1982; 16(5): 959–61.Olarerin-George AO, Hogenesch JB. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI’s RNA-seq archive. Nucleic Acids Res. 2015; 43(5): 2535-42.Olarerin-George AO, Hogenesch JB. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI’s RNA-seq archive. Nucleic Acids Res. 2015; 43(5): 2535–42.van Kuppeveld FJ, van der Logt JT, Angulo AF, van Zoest MJ, Quint WG, Niesters HG, et al. Genus- and species-specific identification of mycoplasmas by 16S rRNA amplification. Appl Environ Microbiol. 1992; 58(8): 2606-15.van Kuppeveld FJ, van der Logt JT, Angulo AF, van Zoest MJ, Quint WG, Niesters HG, et al. Genus- and species-specific identification of mycoplasmas by 16S rRNA amplification. Appl Environ Microbiol. 1992; 58(8): 2606–15.Lincoln CK, Gabridge MG. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods Cell Biol. 1998; 57: 49-65.Lincoln CK, Gabridge MG. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods Cell Biol. 1998; 57: 49–65.ОФС. 1.7.2.0031.15. Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII изд. Т. 2. М.; 2015. С. 827-35. Available from: http://www.femb.ru/feml.OFS. 1.7.2.0031.15. Testing for the presence of mycoplasma. State Pharmacopoeia of the Russian Federation. 13th ed. V. 2. P. 827–35. Available from: http://www.femb.ru/feml.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia 9.0. Available from: http://pharmeuropa.edqm.eu/ep900.2.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia 9.0. Available from: http://pharmeuropa.edqm.eu/ep900.Volokhov DV, Graham LJ, Brorson KA, Chizhikov VE. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes 2011; 25(2 - 3): 69-77.Volokhov DV, Graham LJ, Brorson KA, Chizhikov VE. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes 2011; 25(2 – 3): 69–77.Ёлшин НД. Определение остаточной ДНК клеток-продуцентов E. Coli и CHO в субстанциях рекомбинантых белков методом qPCR. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2016; 16(4): 245-52.Yolshin ND. Detection of residual E. coli and CHO host-cell DNA in recombinant proteins by qPCR. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2016; 16(4): 245–52 (in Russian).Janetzko K, Rink G, Hecker A, Bieback K, Kluter H, Bugert P. A single-tube real-time PCR assay for Mycoplasma detection as a routine quality control of cell therapeutics. Transfus Med Hemother. 2014; 41(1): 83-9.Janetzko K, Rink G, Hecker A, Bieback K, Kluter H, Bugert P. A single-tube real-time PCR assay for Mycoplasma detection as a routine quality control of cell therapeutics. Transfus Med Hemother. 2014; 41(1): 83–9.st WHO International Standard for mycoplasma DNA for nucleic acid amplification technique-based assays designed for generic mycoplasma detection. Available from: https://goo.gl/Ue2xP9.1st WHO International Standard for mycoplasma DNA for nucleic acid amplification technique-based assays designed for generic mycoplasma detection. Available from: https://goo.gl/Ue2xP9.Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, Gorn VV, Lukhtanov EA, Belousov ES, et al. 3’-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 2000; 28(2): 655-61.Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, Gorn VV, Lukhtanov EA, Belousov ES, et al. 3’-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 2000; 28(2): 655–61.Шалунова НВ, Волкова РА, Волгин АР, Петручук ЕМ, Бердникова ЗЕ, Эльберт ЕВ и др. Микоплазмы - контаминанты клеточных культур. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2016; 16(3): 151-60.Shalunova NV, Volkova RA, Volgin AR, Petruchuk EM, Berdnikova ZE, Elbert EV, et al. Mycoplasma contamination of cell cultures. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2016; 16(3): 151–60 (in Russian).Peredeltchouk M, David SA, Bhattacharya B, Volokhov DV, Chizhikov V. Detection of mycoplasma contamination in cell substrates using reverse transcription-PCR assays. J Appl Microbiol. 2011; 110(1): 54-60.Peredeltchouk M, David SA, Bhattacharya B, Volokhov DV, Chizhikov V. Detection of mycoplasma contamination in cell substrates using reverse transcription-PCR assays. J Appl Microbiol. 2011; 110(1): 54–60.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.